Secretomics - Secretomics
La secretómica es un tipo de proteómica que implica el análisis del secretoma, todas las proteínas secretadas de una célula, tejido u organismo. Las proteínas secretadas están involucradas en una variedad de procesos fisiológicos, incluida la señalización celular y la remodelación de la matriz , pero también son parte integral de la invasión y metástasis de células malignas . Por tanto, la secretómica ha sido especialmente importante en el descubrimiento de biomarcadores del cáncer y en la comprensión de las bases moleculares de la patogenia. El análisis de la fracción insoluble del secretoma (la matriz extracelular ) se ha denominado matrisómica.
Historia del secretoma
En 2000, Tjalsma et al. acuñó el término 'secretoma' en su estudio de la eubacteria B. subtilis . Definieron el secretoma como todas las proteínas secretadas y la maquinaria secretora de las bacterias. Usando una base de datos de secuencias de proteínas en B. subtilis y un algoritmo que analizó los sitios de escisión y los péptidos señal amino-terminales característicos de las proteínas secretadas, pudieron predecir qué fracción del proteoma secreta la célula. En 2001, el mismo laboratorio estableció un estándar de secretómica: las predicciones basadas solo en la secuencia de aminoácidos no son suficientes para definir el secretoma. Utilizaron electroforesis en gel bidimensional y espectrometría de masas para identificar 82 proteínas secretadas por B. subtilis , de las cuales solo 48 se habían predicho utilizando el método basado en el genoma de su artículo anterior. Esto demuestra la necesidad de verificar las proteínas de los hallazgos previstos.
A medida que se reveló la naturaleza complicada de las vías secretoras, es decir, que existen muchas vías de secreción no clásicas y muchas proteínas no secretadas que forman parte de la vía secretora clásica, se hizo necesaria una definición más detallada del secretoma. . En 2010, Agrawal et al. sugirió definir el secretoma como "el grupo global de proteínas secretadas en el espacio extracelular por una célula, tejido, órgano u organismo en cualquier momento y condiciones dados a través de mecanismos secretores conocidos y desconocidos que involucran orgánulos secretores constitutivos y regulados".
Desafíos del análisis secretómico
Contaminantes
En cultivo, las células están rodeadas de contaminantes. El suero bovino de los medios de cultivo celular y los restos celulares puede contaminar la colección de proteínas secretadas que se utilizan para el análisis. Los contaminantes bovinos presentan un desafío particular porque las secuencias de proteínas de muchas proteínas extracelulares bovinas, como la fibronectina y la fibulina-1 , son similares a las secuencias de proteínas humanas. Para eliminar estos contaminantes, las células se pueden lavar con PBS o medio sin suero (SFM) antes de incubarlas en SFM y recolectar proteínas secretadas. Se debe tener cuidado de no reventar las células, liberando proteínas intracelulares. Además, el tiempo y las condiciones de incubación deben optimizarse para que el estrés metabólico que puede ser inducido por la falta de nutrientes en SFM no afecte el análisis secretómico.
Baja concentración
Algunas proteínas se secretan en escasa abundancia y luego se diluyen más en el medio de cultivo celular o en el líquido corporal, lo que dificulta la detección y el análisis de estas proteínas. Se pueden usar métodos de concentración como la precipitación con TCA, así como métodos altamente sensibles como microarrays de anticuerpos que pueden detectar incluso moléculas individuales de una proteína.
Relevancia de los estudios in vitro
Muchos estudios secretómicos se realizan in vitro con métodos de cultivo celular, pero no está claro si las mismas proteínas se secretan in vivo . Cada vez más estudios, especialmente los que analizan el secretoma del cáncer, utilizan métodos in vivo para confirmar la relevancia de los resultados obtenidos in vitro . Por ejemplo, se pueden recolectar fluidos biológicos proximales adyacentes a un tumor para realizar un análisis secretómico.
Métodos
Predicción de todo el genoma
Muchas proteínas secretadas tienen una secuencia de péptidos N-terminal que indica a la proteína traducida que se mueva hacia el retículo endoplásmico donde ocurre el procesamiento que finalmente conducirá a la secreción. La presencia de estos péptidos señal se puede utilizar para predecir el secretoma de una célula. El software como SignalP puede identificar secuencias de señales (y sus sitios de escisión) para predecir las proteínas que se secretan. Dado que las proteínas transmembrana también se procesan en el ER, pero no se secretan, se utiliza software como el servidor TMHMM para predecir los dominios transmembrana y, por lo tanto, eliminar los falsos positivos. Algunas proteínas secretoras no tienen secuencias de péptidos señal clásicos. SignalP no detectará estas "proteínas secretoras sin líder" (LSP). SecretomeP es un software que se ha desarrollado para intentar predecir estas proteínas secretoras no clásicas a partir de sus secuencias. Se han predicho secretomos en todo el genoma para una amplia gama de organismos, incluidos humanos, ratones, peces cebra y cientos de bacterias.
Los métodos de predicción de todo el genoma plantean diversos problemas. Existe una alta posibilidad de falsos positivos y falsos negativos. Además, la expresión génica está muy influenciada por las condiciones ambientales, lo que significa que es poco probable que un secretoma predicho a partir del genoma o una biblioteca de ADNc coincida completamente con el secretoma verdadero. Los enfoques proteómicos son necesarios para validar cualquier proteína secretada predicha.
Varias bases de datos o bases de conocimiento de secretomas de genoma están disponibles basadas tanto en la curación como en la predicción computacional. Estas bases de datos incluyen la base de datos del secretoma fúngico (FSD), la base de conocimientos del secretoma fúngico (FunSecKB) y la base de datos del secretoma bacteriano del ácido láctico. La base de datos de ubicación subcelular de proteínas humanas y animales ( MetaSecKB ) y la base de datos de proteomas subcelulares protistas ( ProtSecKB ) también se publicaron recientemente. Aunque hay algunas inexactitudes en la predicción computacional, estas bases de datos proporcionan recursos útiles para caracterizar aún más las ubicaciones subcelulares de proteínas.
Enfoques proteómicos
El análisis de espectrometría de masas es parte integral de la secretomía. El suero o el sobrenadante que contiene proteínas secretadas se digiere con una proteasa y las proteínas se separan mediante electroforesis en gel 2D o métodos cromatográficos . Luego, cada proteína individual se analiza mediante espectrometría de masas y la huella dactilar de péptido-masa generada se puede ejecutar en una base de datos para identificar la proteína.
El marcaje de isótopos estables mediante aminoácidos en cultivo celular (SILAC) ha surgido como un método importante en la secretomía: ayuda a distinguir entre proteínas secretadas y contaminantes del suero bovino en cultivo celular. El sobrenadante de las células cultivadas en medio normal y las células cultivadas en medio con aminoácidos marcados con isótopos estables se mezcla en una proporción de 1: 1 y se analiza mediante espectrometría de masas. Los contaminantes de proteínas en el suero solo mostrarán un pico porque no tienen un equivalente etiquetado. Como ejemplo, el método SILAC se ha utilizado con éxito para distinguir entre proteínas secretadas por condrocitos humanos en cultivo y contaminantes del suero.
Una micromatriz de anticuerpos es un método altamente sensible y de alto rendimiento para la detección de proteínas que recientemente se ha convertido en parte del análisis secretómico. Los anticuerpos , u otro tipo de molécula aglutinante, se fijan sobre un soporte sólido y se agrega una mezcla de proteínas marcada con fluorescencia. Las intensidades de señal se utilizan para identificar proteínas. Los microarrays de anticuerpos son extremadamente versátiles: se pueden usar para analizar la cantidad de proteína en una mezcla, diferentes isoformas de proteína , modificaciones postraduccionales y la actividad bioquímica de las proteínas. Además, estos microarrays son muy sensibles: pueden detectar moléculas individuales de proteína. Los microarrays de anticuerpos se utilizan actualmente sobre todo para analizar muestras de plasma humano , pero también se pueden utilizar para células cultivadas y secretómica de fluidos corporales, lo que presenta una forma sencilla de buscar la presencia de muchas proteínas al mismo tiempo.
Implicaciones e importancia
Descubrimiento de biomarcadores del cáncer
Además de ser importantes en los procesos fisiológicos normales, las proteínas secretadas también tienen un papel integral en la tumorigénesis a través del crecimiento celular, la migración, la invasión y la angiogénesis , lo que hace que la secretomía sea un método excelente para el descubrimiento de biomarcadores del cáncer. El uso de un método proteómico de líquido corporal o suero completo para identificar biomarcadores puede ser extremadamente difícil: los líquidos corporales son complejos y muy variables. El análisis secretómico de líneas de células cancerosas o tejido enfermo presenta una alternativa más simple y específica para el descubrimiento de biomarcadores.
Las dos fuentes biológicas principales de la secretómica del cáncer son los sobrenadantes de la línea celular del cáncer y los fluidos biológicos proximales, los fluidos en contacto con un tumor . El sobrenadante de la línea de células cancerosas es una fuente atractiva de proteínas secretadas. Hay muchas líneas celulares estandarizadas disponibles y el sobrenadante es mucho más simple de analizar que el líquido corporal proximal. Pero no está claro si un secretoma de línea celular es una buena representación de un tumor real en su microambiente específico y una línea celular estandarizada no ilustra la heterogeneidad de un tumor real. El análisis de los fluidos proximales puede dar una mejor idea del secretoma de un tumor humano, pero este método también tiene sus inconvenientes. Los procedimientos para recolectar fluidos proximales aún deben estandarizarse y se necesitan controles no malignos. Además, las diferencias ambientales y genéticas entre pacientes pueden complicar el análisis.
Análisis Secretomic ha descubierto posibles nuevos biomarcadores en muchos tipos de cáncer, incluyendo cáncer de pulmón , cáncer de hígado , cáncer de páncreas , cáncer colorrectal , cáncer de próstata , y cáncer de mama . El antígeno prostático específico (PSA), el biomarcador estándar actual para el cáncer de próstata, tiene una baja especificidad diagnóstica (los niveles de PSA no siempre pueden discriminar entre cáncer agresivo y no agresivo), por lo que se necesita un mejor biomarcador. Mediante el análisis secretómico de líneas celulares de próstata, un estudio pudo descubrir múltiples proteínas que se encuentran en niveles más altos en el suero de pacientes con cáncer que en controles sanos.
También existe una gran necesidad de biomarcadores para la detección del cáncer de mama; actualmente, los biomarcadores solo existen para controlar las etapas posteriores del cáncer. El análisis secretómico de líneas celulares de cáncer de mama condujo al descubrimiento de la proteína ALCAM como un nuevo biomarcador con un potencial diagnóstico prometedor.
Tecnologías de reproducción asistida
El análisis del secretoma embrionario humano podría ser útil para encontrar un método no invasivo para determinar la viabilidad de los embriones . En la FIV , los embriones se evalúan según criterios morfológicos en un intento de encontrar aquellos con alto potencial de implantación . Encontrar un método de evaluación más cuantitativo podría ayudar a reducir la cantidad de embriones utilizados en la FIV, reduciendo así los embarazos de orden superior . Por ejemplo, un estudio pudo desarrollar huellas dactilares secretomas para muchos blastocistos y encontró 9 proteínas que podían distinguir entre blastocistos con números normales y anormales de cromosomas . Este tipo de análisis podría ayudar a reemplazar el cribado genético preimplantacional (PGS), que implica la biopsia de células embrionarias y puede ser perjudicial para el desarrollo.