Tinción de Leishman - Leishman stain
La tinción de Leishman , también conocida como tinción de Leishman , se utiliza en microscopía para teñir frotis de sangre . Generalmente se usa para diferenciar e identificar glóbulos blancos , parásitos de la malaria y tripanosomas . Se basa en una mezcla metanólica de azul de metileno "policromado" (es decir, desmetilado en varios azures) y eosina . La solución madre metanólica es estable y también sirve para fijar directamente el frotis eliminando un paso de prefijación. Si se prepara una solución de trabajo por dilución con un tampón acuoso, la mezcla resultante es muy inestable y no se puede utilizar por mucho tiempo. La tinción de Leishman lleva el nombre de su inventor, el patólogo escocés William Boog Leishman . Es una versión de la tinción de Romanowsky , y es por lo tanto similar a y parcialmente sustituible por tinción de Giemsa , tinción de Jenner , y la tinción de Wright .
Preparación y almacenaje
Muchas empresas venden Leishman Stain en forma de polvo seco, que luego se reconstituye con metanol . El calor y la luz brillante oxidan la mancha y provocan la precipitación de precipitados insolubles, como el violeta de metileno (Bernthsen) o las sales de eosinato azur.
Ventajas y desventajas
Ventajas
Según el libro de texto de Sir John Vivian Dacie , Practical Hematology , "Entre las tinciones de Romanowsky actualmente en uso, la de Jenner es la más simple y la de Giemsa la más compleja. La tinción de Leishman, que ocupa una posición intermedia, todavía se usa ampliamente en la tinción de rutina".
El protocolo de la OMS menciona:
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Hay varias combinaciones diferentes de estos tintes que varían en sus características de tinción. May-Grunwald-Giemsa es un buen método para el trabajo de rutina. La tinción de Wright es un método más simple, mientras que la tinción de Leishman es también un método simple que es especialmente adecuado cuando se requiere urgentemente un frotis de sangre teñido o la tinción de rutina no está disponible (por ejemplo, por la noche). La tinción de Field es una tinción rápida que se usa principalmente en películas delgadas para los parásitos de la malaria. Cualquiera que sea el método que se utilice, es importante seleccionar tintes que no estén contaminados con otros tintes o sales metálicas.
Sir William Boog Leishman de Londres y Karl Reuter de Alemania descubrieron de forma independiente en 1901 lo que se considera "Quizás las modificaciones más prácticas de la tinción de Malachowski" Adoptaron los mejores aspectos de las tinciones desarrolladas por Malachowski y Jenner, es decir, utilizaron azul de metileno policromado (hecho accidentalmente por Romanowsky quien obtuvo el nombre, hecho sistemáticamente por Ernst Malachowski incluso antes de Romanowsky, y redescubierto por Bernhard Nocht , pero desconocido para Jenner, May, Grunwald y muchos otros que usaron azul de metileno simple) y filtrando el precipitado de eosinato azur del mezcla acuosa y redisolución en un solvente alcohólico (sabiduría de Jenner). Las diferencias entre los métodos de Leishman y Reuter fueron: Leishman usó metanol (como Jenner) y sustituyó Eosina B por Eosina Y, mientras que Reuter usó alcohol etílico y enfatizó con razón la importancia de usar un solvente absolutamente puro. Ambos métodos produjeron una mancha estable y el color púrpura deseado.
Buen contraste
La tinción de Leishman generalmente muestra el color violeta brillante del núcleo y los gránulos de neutrófilos para los que el recuento diferencial se vuelve conveniente y hace que la calidad de la tinción sea mejor que las tinciones que son simples a base de azul de metileno y eosina, que no producen suficiente contraste entre el citoplasma y el núcleo. Dado que Leishman, al igual que otras tinciones de Romanowsky, tiñe los detalles citoplásmicos y los gránulos, los mejores hematólogos generalmente los prefieren (sin embargo, consulte más abajo sobre citólogos). En comparación con los costosos y tóxicos reactivos sintéticos puros basados en AZure B y Eosina Y utilizados por los métodos de referencia ICSH que tampoco están exentos de la desventaja de oxidarse y eventualmente dar un tono gris en lugar de los colores azules óptimos para el citoplasma, Leishman es un producto económico. técnica fácilmente disponible y fácil de hacer que proporciona un contraste bastante aceptable.
Buena sensibilidad para el parásito de la malaria.
Se ha documentado que la tinción de Leishman es más sensible que la tinción de Field y tan buena como las tinciones fluorescentes para la detección del parásito de la malaria.
Desventajas
Dificultad para controlar la proporción molar
La composición del azul de metileno policromado mezclado con eosina nunca es tan buena como las proporciones directamente pesadas y mezcladas en los tintes tipo Giemsa. Albert Plehn en 1890 había descubierto que la proporción molar de tintes básicos a ácidos tenía que aumentarse de 2: 1 a 3: 1, sin embargo, desde la época de Jenners (1899) el uso de los cristales de eosinato de azur trajo la proporción de nuevo a la insatisfactoria 2: 1 y la profundidad del color se hizo menor. Fue solo el trabajo de Gustav Giemsa y similares que nuevamente controlaron manualmente la proporción de estos dos componentes lo que devolvió la profundidad de la tinción. Sin embargo, Giemsa y otros que controlaron artificialmente la proporción a veces iban al otro extremo (un gran exceso molar de Azure hasta una proporción de 16,1) que probablemente era innecesario. según ICSH, la proporción óptima es de 6,5 a 7,3.
Inestabilidad
La tinción de Leishman, si se reconstituye con tampón, se vuelve muy inestable (en contraste con Giemsa, que es relativamente más estable debido al glicerol, o las tinciones de referencia ICSH que usan metanol + DMSO en una proporción de 6: 4 v / v) y comienza a precipitar y necesita filtración repetida. . Si no se supervisa cuidadosamente, la absorción de agua, la evaporación del metanol de un recipiente abierto y el filtrado repetido cambian la composición y requieren cambios frecuentes y hacen que este método sea un desperdicio. Si no se filtra, los depósitos de precipitado en el frotis pueden confundirse con plaquetas. Es importante no agitar el frasco de tinte antes de usarlo, de lo contrario, los precipitados sedimentados se resuspenderían y se depositarían en las películas durante la tinción y causarían numerosos artefactos y dificultarían mucho la microscopía.
El contraste citoplasmático es bueno pero el contraste nuclear no es tan bueno como H&E
Como todos los demás métodos de Malachowski-Romanowsky-Giemsa, se desvanece con el tiempo y no se puede archivar de forma estable por mucho tiempo. Además, sus contrapartes anteriores tiñen los núcleos de color púrpura oscuro y los detalles de las características nucleares no son tan claros como el hematoxileno y la eosina , que son los preferidos por algunos citopatólogos. Pero de esa manera es un método complementario (ya que tiñe los gránulos de detalles citoplásmicos, etc. mejor que la tinción H&E ).