Vector (biología molecular) - Vector (molecular biology)

Para otros usos, consulte Vector .

En la clonación molecular , un vector es una molécula de ADN utilizada como vehículo para transportar artificialmente material genético extraño a otra célula , donde puede replicarse y / o expresarse (p. Ej., Plásmido , cósmido , fagos Lambda ). Un vector que contiene ADN extraño se denomina ADN recombinante . Los cuatro tipos principales de vectores son plásmidos , vectores virales , cósmidos y cromosomas artificiales . De estos, los vectores más utilizados son los plásmidos. Todos los vectores modificados tienen un origen de replicación común , un sitio de clonación múltiple y un marcador seleccionable .

El vector en sí mismo es generalmente una secuencia de ADN que consta de un inserto ( transgén ) y una secuencia más grande que sirve como "columna vertebral" del vector. El propósito de un vector que transfiere información genética a otra célula es típicamente aislar, multiplicar o expresar el inserto en la célula diana. Todos los vectores pueden usarse para la clonación y, por lo tanto, son vectores de clonación , pero también hay vectores diseñados especialmente para la clonación, mientras que otros pueden diseñarse específicamente para otros fines, como la transcripción y la expresión de proteínas. Los vectores diseñados específicamente para la expresión del transgén en la célula diana se denominan vectores de expresión y generalmente tienen una secuencia promotora que dirige la expresión del transgén. Los vectores más simples llamados vectores de transcripción solo pueden transcribirse pero no traducirse: pueden replicarse en una célula diana pero no expresarse, a diferencia de los vectores de expresión. Los vectores de transcripción se utilizan para amplificar su inserto.

La manipulación del ADN se realiza normalmente en vectores de E. coli , que contienen elementos necesarios para su mantenimiento en E. coli . Sin embargo, los vectores también pueden tener elementos que les permitan mantenerse en otro organismo como células de levadura, plantas o mamíferos, y estos vectores se denominan vectores lanzadera . Dichos vectores tienen elementos bacterianos o virales que pueden transferirse al organismo huésped no bacteriano; sin embargo, también se han desarrollado otros vectores denominados vectores intragénicos para evitar la transferencia de cualquier material genético de una especie exótica.

La inserción de un vector en la célula diana generalmente se denomina transformación para células bacterianas, transfección para células eucariotas , aunque la inserción de un vector viral a menudo se denomina transducción .

Caracteristicas

Plásmidos

Artículo principal: vector de plásmido

Los plásmidos son secuencias de ADN extra cromosómicas y generalmente circulares de doble hebra que son capaces de replicarse utilizando la maquinaria de replicación de la célula huésped. Los vectores plasmídicos consisten minimalistamente en un origen de replicación que permite la replicación semiindependiente del plásmido en el hospedador. Los plásmidos se encuentran ampliamente en muchas bacterias, por ejemplo en Escherichia coli , pero también se pueden encontrar en algunos eucariotas, por ejemplo en levaduras como Saccharomyces cerevisiae . Los plásmidos bacterianos pueden ser conjugativos / transmisibles y no conjugativos:

  • conjugativo: media la transferencia de ADN a través de la conjugación y, por lo tanto, se propaga rápidamente entre las células bacterianas de una población; por ejemplo, plásmido F, muchos plásmidos R y algunos col.
  • no conjugativo: no median el ADN a través de la conjugación, por ejemplo, muchos plásmidos R y col.
El plásmido pBR322 es uno de los primeros plásmidos ampliamente utilizado como vector de clonación .

Los plásmidos con características especialmente construidas se utilizan comúnmente en el laboratorio con fines de clonación . Estos plásmidos generalmente no son conjugativos pero pueden tener muchas más características, en particular un " sitio de clonación múltiple " donde múltiples sitios de escisión de enzimas de restricción permiten la inserción de un inserto transgénico. Las bacterias que contienen los plásmidos pueden generar millones de copias del vector dentro de las bacterias en horas, y los vectores amplificados pueden extraerse de las bacterias para su posterior manipulación. Los plásmidos pueden usarse específicamente como vectores de transcripción y tales plásmidos pueden carecer de secuencias cruciales para la expresión de proteínas. Los plásmidos utilizados para la expresión de proteínas, denominados vectores de expresión , incluirían elementos para la traducción de proteínas, como un sitio de unión a ribosomas , codones de inicio y finalización .

Vectores virales

Artículo principal: vector viral

Los vectores virales son generalmente virus manipulados genéticamente que llevan ADN o ARN vírico modificado que se ha vuelto no infeccioso, pero que todavía contienen promotores virales y también el transgén, lo que permite la traducción del transgén a través de un promotor viral. Sin embargo, debido a que los vectores virales con frecuencia carecen de secuencias infecciosas, requieren virus auxiliares o líneas de empaquetamiento para la transfección a gran escala. Los vectores virales se diseñan a menudo para la incorporación permanente del inserto en el genoma del huésped y, por tanto, dejan marcadores genéticos distintos en el genoma del huésped después de incorporar el transgén. Por ejemplo, los retrovirus dejan un patrón de integración retroviral característico después de la inserción que es detectable e indica que el vector viral se ha incorporado al genoma del huésped.

Cromosomas artificiales

Artículo principal: cromosoma artificial (desambiguación)

Los cromosomas artificiales son cromosomas fabricados en el contexto de cromosomas artificiales de levadura (YAC), cromosomas artificiales bacterianos (BAC) o cromosomas artificiales humanos (HAC). Un cromosoma artificial puede transportar un fragmento de ADN mucho más grande que otros vectores. Los YAC y BAC pueden transportar un fragmento de ADN de hasta 300.000 nucleótidos de longitud. Tres necesidades estructurales de un cromosoma artificial incluyen un origen de replicación, un centrómero y secuencias terminales teloméricas.

Transcripción

La transcripción del gen clonado es un componente necesario del vector cuando se requiere la expresión del gen: un gen puede amplificarse mediante transcripción para generar múltiples copias de ARNm , la plantilla sobre la que se puede producir la proteína mediante traducción. Un mayor número de ARNm expresaría una mayor cantidad de proteína y la cantidad de copias de ARNm que se generan depende del promotor utilizado en el vector. La expresión puede ser constitutiva, lo que significa que la proteína se produce constantemente en segundo plano, o puede ser inducible por lo que la proteína se expresa solo en determinadas condiciones, por ejemplo, cuando se añade un inductor químico. Estos dos tipos diferentes de expresión dependen de los tipos de promotor y operador utilizados.

Los promotores virales se utilizan a menudo para la expresión constitutiva en plásmidos y en vectores virales porque normalmente fuerzan la transcripción constante en muchas líneas y tipos celulares de forma fiable. La expresión inducible depende de los promotores que responden a las condiciones de inducción: por ejemplo, el promotor del virus del tumor mamario murino solo inicia la transcripción después de la aplicación de dexametasona y el promotor de choque térmico de Drosophilia solo se inicia después de altas temperaturas.

Algunos vectores están diseñados solo para transcripción, por ejemplo, para la producción de ARNm in vitro . Estos vectores se denominan vectores de transcripción. Pueden carecer de las secuencias necesarias para la poliadenilación y terminación, por lo que no se pueden utilizar para la producción de proteínas.

Expresión

Artículo principal: vector de expresión

Los vectores de expresión producen proteínas a través de la transcripción del inserto del vector seguida de la traducción del ARNm producido, por lo que requieren más componentes que los vectores de solo transcripción más simples. La expresión en diferentes organismos hospedadores requeriría diferentes elementos, aunque comparten requisitos similares, por ejemplo, un promotor para el inicio de la transcripción, un sitio de unión ribosomal para el inicio de la traducción y señales de terminación.

Vector de expresión de procariotas

  • Promotor: los promotores inducibles comúnmente usados ​​son promotores derivados del operón lac y el promotor T7 . Otros promotores fuertes usados ​​incluyen el promotor Trp y el promotor Tac , que son un híbrido de los promotores Trp y Lac Operon.
  • Sitio de unión al ribosoma (RBS): sigue al promotor y promueve la traducción eficiente de la proteína de interés.
  • Sitio de inicio de la traducción: secuencia de Shine-Dalgarno incluida en el RBS, 8 pares de bases cadena arriba del codón de inicio AUG.

Vector de expresión eucariotas

Los vectores de expresión eucariotas requieren secuencias que codifiquen:

  • Cola de poliadenilación : crea una cola de poliadenilación al final del pre-ARNm transcrito que protege el ARNm de exonucleasas y asegura la terminación transcripcional y traduccional: estabiliza la producción de ARNm.
  • Longitud mínima de UTR : las UTR contienen características específicas que pueden impedir la transcripción o traducción y, por lo tanto, las UTR más cortas o ninguna se codifican en vectores de expresión óptimos.
  • Secuencia de Kozak : los vectores deben codificar una secuencia de Kozak en el ARNm, que ensambla el ribosoma para la traducción del ARNm.

Características

Los vectores modernos construidos artificialmente contienen componentes esenciales que se encuentran en todos los vectores y pueden contener otras características adicionales que se encuentran solo en algunos vectores:

  • Origen de replicación : Necesario para la replicación y mantenimiento del vector en la célula huésped.
  • Promotor : los promotores se utilizan para impulsar la transcripción del transgén del vector, así como los otros genes en el vector, como el gen de resistencia a los antibióticos. Algunos vectores de clonación no necesitan tener un promotor para el inserto clonado, pero es un componente esencial de los vectores de expresión para que el producto clonado pueda expresarse.
  • Sitio de clonación: puede ser un sitio de clonación múltiple u otras características que permitan la inserción de ADN extraño en el vector mediante ligación .
  • Marcadores genéticos : los marcadores genéticos de los vectores virales permiten confirmar que el vector se ha integrado con el ADN genómico del huésped.
  • Resistencia a los antibióticos : los vectores con marcos de lectura abiertos de resistencia a los antibióticos permiten la supervivencia de las células que han absorbido el vector en medios de crecimiento que contienen antibióticos a través de la selección de antibióticos.
  • Epítopo : algunos vectores pueden contener una secuencia para un epítopo específico que puede incorporarse en la proteína expresada. Permite la identificación de anticuerpos de las células que expresan la proteína diana.
  • Genes informadores: algunos vectores pueden contener un gen informador que permite la identificación del plásmido que contiene la secuencia de ADN insertada. Un ejemplo es lacZ-α que codifica el fragmento N-terminal de la β-galactosidasa , una enzima que digiere la galactosa . Un sitio de clonación múltiple se encuentra dentro de lacZ-α , y un inserto ligado con éxito en el vector interrumpirá la secuencia del gen, dando como resultado una β-galactosidasa inactiva. Las células que contienen el vector con un inserto pueden identificarse usando selección azul / blanco cultivando células en medios que contienen un análogo de galactosa ( X-gal ). Las células que expresan β-galactosidasa (por lo tanto, no contienen inserto) aparecen como colonias azules. Las colonias blancas se seleccionarían como aquellas que pueden contener un inserto. Otros indicadores de uso común incluyen la proteína verde fluorescente y la luciferasa .
  • Secuencia de dirección: los vectores de expresión pueden incluir la codificación de una secuencia de dirección en la proteína terminada que dirige la proteína expresada a un orgánulo específico en la célula o ubicación específica, como el espacio periplásmico de las bacterias.
  • Etiquetas de purificación de proteínas : algunos vectores de expresión incluyen proteínas o secuencias de péptidos que permiten una purificación más fácil de la proteína expresada. Los ejemplos incluyen polihistidina-etiqueta , glutatión-S-transferasa y proteína de unión a maltosa . Algunas de estas etiquetas también pueden permitir una mayor solubilidad de la proteína diana. La proteína diana se fusiona con la etiqueta de la proteína, pero un sitio de escisión de la proteasa situado en la región de unión del polipéptido entre la proteína y la etiqueta permite que la etiqueta se elimine más tarde.

Ver también

Referencias

Otras lecturas

  • Freshney IR (29 de julio de 2005). Cultivo de células animales: manual de técnica básica . Hoboken, Nueva Jersey: John Wiley & Sons, Inc. ISBN 978-0-471-45329-1.

enlaces externos