Cromatografía bidimensional - Two-dimensional chromatography
La cromatografía bidimensional es un tipo de técnica cromatográfica en la que la muestra inyectada se separa pasando por dos etapas de separación diferentes. Se conectan en secuencia dos columnas cromatográficas diferentes y el efluente del primer sistema se transfiere a la segunda columna. Normalmente, la segunda columna tiene un mecanismo de separación diferente, de modo que las bandas que están mal resueltas de la primera columna pueden separarse completamente en la segunda columna. (Por ejemplo, una columna de cromatografía de fase inversa C18 puede ir seguida de una columna de fenilo). Alternativamente, las dos columnas pueden funcionar a diferentes temperaturas. Durante la segunda etapa de separación, la velocidad a la que ocurre la separación debe ser más rápida que la primera etapa, ya que todavía hay un solo detector. La superficie plana es susceptible de revelado secuencial en dos direcciones utilizando dos disolventes diferentes.
Historia
Las técnicas cromatográficas bidimensionales modernas se basan en los resultados de los primeros desarrollos de la cromatografía en papel y la cromatografía en capa fina, que incluían fases móviles líquidas y fases estacionarias sólidas. Posteriormente, estas técnicas generarían análisis modernos de cromatografía de gases y cromatografía líquida . Diferentes combinaciones de GC y LC unidimensionales produjeron la técnica cromatográfica analítica que se conoce como cromatografía bidimensional.
La forma más temprana de cromatografía 2D llegó en forma de una separación por TLC de varios pasos en la que se usa una hoja delgada de celulosa primero con un solvente en una dirección, luego, después de que el papel se ha secado, se pasa otro solvente en un dirección perpendicular a la primera. Esta metodología apareció por primera vez en la literatura con una publicación de 1944 de AJP Martin y colaboradores que detalla un método eficiente para separar aminoácidos - "... pero el cromatograma bidimensional es especialmente conveniente, ya que muestra de un vistazo información que puede ser ganado de otra manera sólo como resultado de numerosos experimentos "(Biochem J., 1944, 38, 224).
Ejemplos de
Las separaciones bidimensionales se pueden realizar en cromatografía de gases o cromatografía líquida . Se han desarrollado diversas estrategias de acoplamiento para "remuestrear" desde la primera columna a la segunda. Algunos componentes importantes para las separaciones bidimensionales son el interruptor y el modulador de Deans, que transfieren selectivamente el eluyente de la primera dimensión a la columna de la segunda dimensión.
La principal ventaja de las técnicas bidimensionales es que ofrecen un gran aumento en la capacidad máxima, sin requerir separaciones extremadamente eficientes en ninguna de las columnas. (Por ejemplo, si la primera columna ofrece una capacidad máxima (k 1 ) de 100 para una separación de 10 minutos, y la segunda columna ofrece una capacidad máxima de 5 (k 2 ) en una separación de 5 segundos, entonces el pico combinado la capacidad puede acercarse a k 1 × k 2 = 500, con el tiempo total de separación todavía ~ 10 minutos). Las separaciones 2D se han aplicado al análisis de gasolina y otras mezclas de petróleo y, más recientemente, a mezclas de proteínas.
Espectrometría de masas en tándem
La espectrometría de masas en tándem (Tandem MS o MS / MS) utiliza dos analizadores de masas en secuencia para separar mezclas más complejas de analitos. La ventaja de la MS en tándem es que puede ser mucho más rápido que otros métodos bidimensionales, con tiempos que van desde milisegundos a segundos. Debido a que no hay dilución con disolventes en la EM, hay menos probabilidad de interferencia, por lo que la EM en tándem puede ser más sensible y tener una relación señal / ruido más alta en comparación con otros métodos bidimensionales. La principal desventaja asociada con la MS en tándem es el alto costo de la instrumentación necesaria. Los precios pueden oscilar entre $ 500,000 y más de $ 1 millón. Muchas formas de EM en tándem implican un paso de selección masiva y un paso de fragmentación. El primer analizador de masas se puede programar para que solo pase moléculas de una relación masa-carga específica. Luego, el segundo analizador de masas puede fragmentar la molécula para determinar su identidad. Esto puede ser especialmente útil para separar moléculas de la misma masa (es decir, proteínas de la misma masa o isómeros moleculares). Se pueden acoplar diferentes tipos de analizadores de masas para lograr diferentes efectos. Un ejemplo sería un sistema TOF - Quadrople . Los iones se pueden fragmentar y / o analizar secuencialmente en un cuadrupolo a medida que salen del TOF en orden creciente de m / z. Otro espectrómetro de masas en tándem predominante es el analizador de cuadrupolo-cuadrupolo-cuadrupolo (QQQ). El primer cuadrupolo se separa por masa, las colisiones tienen lugar en el segundo cuadrupolo y los fragmentos se separan por masa en el tercer cuadrupolo.
Cromatografía de gases-espectrometría de masas
La cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) es una técnica de cromatografía bidimensional que combina la técnica de separación de la cromatografía de gases con la técnica de identificación de la espectrometría de masas . GC-MS es la herramienta analítica más importante para el análisis de compuestos orgánicos volátiles y semivolátiles en mezclas complejas. Funciona inyectando primero la muestra en la entrada del GC donde es vaporizada y empujada a través de una columna por un gas portador, típicamente helio. Los analitos de la muestra se separan en función de su interacción con el revestimiento de la columna, o la fase estacionaria, y el gas portador, o la fase móvil. Los compuestos eluidos de la columna se convierten en iones mediante impacto de electrones (EI) o ionización química (CI) antes de viajar a través del analizador de masas. El analizador de masas sirve para separar los iones sobre una base de masa a carga. Las elecciones populares realizan la misma función pero difieren en la forma en que logran la separación. Los analizadores que se utilizan normalmente con GC-MS son el analizador de masas de tiempo de vuelo y el analizador de masas de cuadrupolo . Después de salir del analizador de masas, los analitos llegan al detector y producen una señal que es leída por una computadora y utilizada para crear un cromatograma de gases y un espectro de masas. A veces, GC-MS utiliza dos cromatógrafos de gases en muestras particularmente complejas para obtener un poder de separación considerable y poder asignar de manera inequívoca las especies específicas a los picos apropiados en una técnica conocida como GCxGC- (MS). En última instancia, GC-MS es una técnica utilizada en muchos laboratorios analíticos y es una herramienta analítica muy eficaz y adaptable.
Espectrometría de masas de cromatografía líquida
La cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC / MS) combina la separación cromatográfica de alta resolución con la detección de MS. A medida que el sistema adopta la alta separación de HPLC, los analitos que se encuentran en la fase móvil líquida a menudo se ionizan mediante varios métodos de ionización suave, incluida la ionización química a presión atmosférica (APCI), la ionización por electropulverización (ESI) o la desorción / ionización láser asistida por matriz (MALDI). ), que alcanza la ionización en fase gaseosa necesaria para el acoplamiento con MS. Estos métodos de ionización permiten el análisis de una gama más amplia de moléculas biológicas, incluidas aquellas con masas más grandes, compuestos térmicamente inestables o no volátiles donde la GC-MS es típicamente incapaz de analizar.
LC-MS proporciona una alta selectividad ya que los picos no resueltos se pueden aislar seleccionando una masa específica. Además, también se logra una mejor identificación mediante espectros de masas y el usuario no tiene que depender únicamente del tiempo de retención de los analitos. Como resultado, la masa molecular y la información estructural, así como los datos cuantitativos, se pueden obtener mediante LC-MS. Por lo tanto, la LC-MS se puede aplicar a varios campos, como la identificación de impurezas y la elaboración de perfiles en el desarrollo de fármacos y la fabricación farmacéutica, ya que la LC proporciona una separación eficiente de impurezas y la MS proporciona una caracterización estructural para la elaboración de perfiles de impurezas.
Los disolventes habituales que se utilizan en la CL en fase normal o inversa, como el agua, el acetonitrilo y el metanol, son todos compatibles con ESI; sin embargo, es posible que un disolvente de grado LC no sea adecuado para la EM. Además, deben evitarse los tampones que contienen iones inorgánicos, ya que pueden contaminar la fuente de iones. No obstante, el problema puede resolverse mediante LC-MS 2D, así como otros problemas diversos, incluida la coelución de analitos y las respuestas de detección UV.
Cromatografía líquida-cromatografía líquida
La cromatografía líquida bidimensional (2D-LC) combina dos análisis separados de cromatografía líquida en un análisis de datos. La cromatografía líquida 2-D moderna tiene sus orígenes a finales de la década de 1970 y principios de la de 1980. Durante este tiempo, los principios hipotéticos de 2D-LC fueron probados a través de experimentos llevados a cabo junto con trabajo conceptual y teórico complementario. Se demostró que 2D-LC podría ofrecer bastante más poder de resolución en comparación con las técnicas convencionales de cromatografía líquida unidimensional. En la década de 1990, la técnica de 2D-LC jugó un papel importante en la separación de sustancias y materiales extremadamente complejos que se encuentran en los campos de estudio de la proteómica y los polímeros. Desafortunadamente, se ha demostrado que la técnica tiene una desventaja significativa en lo que respecta al tiempo de análisis. El trabajo inicial con 2D-LC se limitó a una pequeña parte de las separaciones de fase líquida debido al largo tiempo de análisis de la maquinaria. Las técnicas modernas de 2D-LC abordaron esa desventaja de frente y han reducido significativamente lo que alguna vez fue una característica dañina. El 2D-LC moderno tiene una capacidad instrumental para que las separaciones de alta resolución se completen en una hora o menos. Debido a la creciente necesidad de instrumentación para realizar análisis de sustancias de creciente complejidad con mejores límites de detección, el desarrollo de 2D-LC avanza. Las partes instrumentales se han convertido en un enfoque principal de la industria y son mucho más fáciles de obtener que antes. Antes de esto, 2D-LC se realizó utilizando componentes de instrumentos 1D-LC, y conduciría a resultados de diversos grados tanto en exactitud como en precisión. La reducción del estrés en la ingeniería instrumental ha permitido un trabajo pionero en el campo y la técnica de 2D-LC.
El propósito de emplear esta técnica es separar mezclas que, de otro modo, la cromatografía líquida unidimensional no podría separar eficazmente. La cromatografía líquida bidimensional es más adecuada para analizar muestras de mezclas complejas como orina, sustancias ambientales y pruebas forenses como sangre.
Las dificultades para separar mezclas pueden atribuirse a la complejidad de la mezcla en el sentido de que la separación no puede ocurrir debido al número de efluentes diferentes en el compuesto. Otro problema asociado con la cromatografía líquida unidimensional implica la dificultad asociada a la resolución de compuestos estrechamente relacionados. Los compuestos estrechamente relacionados tienen propiedades químicas similares que pueden resultar difíciles de separar en función de la polaridad, la carga, etc. La cromatografía líquida bidimensional proporciona una separación basada en más de una propiedad química o física. Usando un ejemplo de Nagy y Vekey, se puede separar una mezcla de péptidos en función de su basicidad, pero es posible que péptidos similares no eluyan bien. Usando una técnica de LC posterior, la basicidad similar entre los péptidos puede separarse aún más empleando diferencias en el carácter apolar.
Como resultado, para poder separar mezclas de manera más eficiente, un análisis LC posterior debe emplear una selectividad de separación muy diferente con respecto a la primera columna. Otro requisito para utilizar eficazmente la cromatografía líquida 2D, según Bushey y Jorgenson, es emplear técnicas altamente ortogonales, lo que significa que las dos técnicas de separación deben ser lo más diferentes posible.
Hay dos clasificaciones principales de cromatografía líquida 2D. Estos incluyen: Cromatografía líquida 2D integral (LCxLC) y Cromatografía líquida 2D de corte de corazón (LC-LC). En 2D-LC completo, todos los picos de una elución de columna se muestrean por completo, pero se ha considerado innecesario transferir toda la muestra de la primera a la segunda columna. Una parte de la muestra se envía a la basura mientras que el resto se envía a la válvula de muestreo. En los picos específicos de 2D-LC que cortan el corazón, se apuntan con solo una pequeña porción del pico que se inyecta en una segunda columna. El 2D-LC rompecorazones ha demostrado ser bastante útil para el análisis de muestras de sustancias que no son muy complejas, siempre que tengan un comportamiento de retención similar. En comparación con el 2D-LC completo, el 2D-LC ofrece una técnica eficaz con mucha menos configuración del sistema y un costo operativo mucho menor. Se pueden utilizar múltiples cortes de corazón (mLC-LC) para muestrear múltiples picos del análisis de la primera dimensión sin correr el riesgo de una superposición temporal del análisis de la segunda dimensión. El corte de corazón múltiple (mLC-LC) utiliza una configuración de múltiples bucles de muestreo.
Para 2D-LC, la capacidad máxima es un tema muy importante. Esto se puede generar usando separación de elución en gradiente con una eficiencia mucho mayor que una separación isocrática en un período de tiempo razonable. Si bien la elución isocrática es mucho más fácil en una escala de tiempo rápida, es preferible realizar una separación de elución en gradiente en la segunda dimensión. La fuerza de la fase móvil varía de una composición de eluyente débil a una más fuerte. Según la teoría de la fuerza lineal del disolvente (LSST) de elución en gradiente para cromatografía de fase inversa, a continuación se muestra la relación entre el tiempo de retención, las variables instrumentales y los parámetros del soluto.
t R = t 0 + t D + t 0 / segundo * ln (segundo * (k 0 -t d / t 0 ) + 1)
Si bien se ha completado una gran cantidad de trabajo pionero en los años desde que 2D-LC se convirtió en una técnica cromatográfica analítica importante, todavía quedan muchos problemas modernos por considerar. Aún no se han decidido grandes cantidades de variables experimentales y la técnica está en constante desarrollo.
Cromatografía de gases - cromatografía de gases
La cromatografía de gases bidimensional integral es una técnica analítica que separa y analiza mezclas complejas. Se ha utilizado en campos como: sabor, fragancias, estudios ambientales, productos farmacéuticos, productos del petróleo y ciencia forense. GCxGC proporciona un alto rango de sensibilidad y produce un mayor poder de separación debido a la mayor capacidad de pico.