Secuenciación por ligadura - Sequencing by ligation
La secuenciación por ligación es un método de secuenciación de ADN que utiliza la enzima ADN ligasa para identificar el nucleótido presente en una posición determinada en una secuencia de ADN. A diferencia de los métodos de secuenciación de ADN más populares actualmente, este método no utiliza una ADN polimerasa para crear una segunda hebra. En su lugar, la sensibilidad al desajuste de una enzima ADN ligasa se usa para determinar la secuencia subyacente de la molécula de ADN diana.
Proceso
La ADN ligasa es una enzima que une los extremos de las moléculas de ADN. Aunque comúnmente se representa como uniendo dos pares de extremos a la vez, como en la ligación de fragmentos de enzimas de restricción , la ligasa también puede unir los extremos en solo una de las dos hebras (por ejemplo, cuando la otra hebra ya es continua o carece de un fosfato terminal necesario para la ligadura). La ADN ligasa es sensible a la estructura del ADN y tiene una eficacia muy baja cuando hay desajustes entre las bases de las dos cadenas.
La secuenciación por ligación se basa en la sensibilidad de la ADN ligasa para los desajustes de apareamiento de bases. La molécula diana que se va a secuenciar es una hebra sencilla de secuencia de ADN desconocida, flanqueada en al menos un extremo por una secuencia conocida. Se introduce una hebra corta de "anclaje" para unir la secuencia conocida.
A continuación, se introduce un conjunto mixto de oligonucleótidos de sonda (de ocho o nueve bases de largo), marcado (normalmente con tintes fluorescentes) según la posición que se secuenciará. Estas moléculas se hibridan con la secuencia de ADN diana, junto a la secuencia de anclaje, y la ligasa de ADN une preferentemente la molécula al ancla cuando sus bases coinciden con la secuencia de ADN desconocida. Con base en la fluorescencia producida por la molécula, se puede inferir la identidad del nucleótido en esta posición en la secuencia desconocida.
Las sondas de oligonucleótidos también se pueden construir con enlaces escindibles que se pueden escindir después de identificar el marcador. Esto eliminará la etiqueta y regenerará un fosfato 5 'en el extremo de la sonda ligada, preparando el sistema para otra ronda de ligadura. Este ciclo se puede repetir varias veces para leer secuencias más largas. Esta secuencia cada base N, donde N es la longitud de la sonda que queda después de la escisión. Para secuenciar las posiciones omitidas, el ancla y los oligonucleótidos ligados pueden separarse de la secuencia de ADN diana y comenzar otra ronda de secuenciación por ligación con un ancla de una o más bases más corta.
Una técnica más simple, aunque más limitada, es realizar rondas repetidas de una sola ligadura en la que el marcador corresponde a una posición diferente en la sonda, seguido de la extracción del ancla y la sonda ligada.
La secuenciación por ligación puede realizarse en cualquier dirección (5'-3 'o 3'-5') dependiendo de qué extremo de la sonda de oligonucleótidos esté bloqueado por el marcador. La dirección 3'-5 'es más eficiente para realizar múltiples ciclos de ligadura. Tenga en cuenta que esta es la dirección opuesta a los métodos de secuenciación basados en polimerasa.
Limitaciones
Se ha informado que esta secuenciación por método de ligación tiene problemas para secuenciar secuencias palindrómicas.