Edición de ARN - RNA editing

La edición de ARN (también modificación de ARN ) es un proceso molecular mediante el cual algunas células pueden realizar cambios discretos en secuencias de nucleótidos específicas dentro de una molécula de ARN después de haber sido generada por la ARN polimerasa . Ocurre en todos los organismos vivos y es una de las propiedades de los ARN más conservadas evolutivamente . La edición de ARN puede incluir la inserción, deleción y sustitución de bases de nucleótidos dentro de la molécula de ARN. La edición de ARN es relativamente rara, y las formas comunes de procesamiento de ARN (por ejemplo , empalme , taponamiento 5 'y poliadenilación 3' ) no se suelen considerar como edición. Puede afectar la actividad, la localización y la estabilidad de los ARN y se ha relacionado con enfermedades humanas.

Se ha observado edición de ARN en algunas moléculas de ARNt , ARNr , ARNm o miARN de eucariotas y sus virus , arqueas y procariotas . La edición de ARN ocurre en el núcleo celular y el citosol , así como dentro de las mitocondrias y plástidos . En los vertebrados, la edición es poco común y generalmente consiste en una pequeña cantidad de cambios en la secuencia de las moléculas afectadas. En otros organismos, como los calamares , puede producirse una edición extensa (edición panorámica ); en algunos casos, la mayoría de los nucleótidos en una secuencia de ARNm pueden resultar de la edición. Hasta ahora se han descrito más de 160 tipos de modificaciones de ARN.

Los procesos de edición de ARN muestran una gran diversidad molecular, y algunos parecen ser adquisiciones evolutivamente recientes que surgieron de forma independiente. La diversidad de ARN edición fenómenos incluye nucleobases modificaciones tales como la citidina (C) a la uridina (U) y la adenosina (A) a inosina (I) deaminations , así como adiciones e inserciones de nucleótidos no de plantilla. La edición de ARN en ARNm altera eficazmente la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada para que difiera de la predicha por la secuencia de ADN genómico.

El complejo editosoma

Detección de edición de ARN

Secuenciación de próxima generación

Para identificar diversas modificaciones postranscripcionales de moléculas de ARN y determinar el panorama de modificaciones de ARN en todo el transcriptoma mediante la secuenciación de ARN de próxima generación, recientemente muchos estudios han desarrollado métodos de secuenciación convencionales o especializados. Ejemplos de métodos especializados son MeRIP-seq , m6A-seq, PA-m 5 C-seq , metilación-iCLIP, m6A-CLIP, Pseudo-seq, Ψ-seq, CeU-seq, Aza-IP y RiboMeth-seq). Muchos de estos métodos se basan en la captura específica de las especies de ARN que contienen la modificación específica, por ejemplo, mediante la unión de anticuerpos junto con la secuenciación de las lecturas capturadas. Después de la secuenciación, estas lecturas se mapean en todo el transcriptoma para ver de dónde se originan. Generalmente con este tipo de enfoque es posible ver la ubicación de las modificaciones junto con la posible identificación de algunas secuencias de consenso que podrían ayudar a la identificación y mapeo más adelante. Un ejemplo de los métodos de especialización es PA-m 5 C-seq. Este método se desarrolló aún más a partir del método PA-m 6 A-seq para identificar modificaciones de m 5 C en el ARNm en lugar de la N6-metiladenosina diana original. El fácil cambio entre diferentes modificaciones como diana es posible con un simple cambio de la forma del anticuerpo de captura m6A específico a m 5 C específico. La aplicación de estos métodos ha identificado varias modificaciones (p. Ej. , Pseudouridina , m 6 A , m5C, 2'-O-Me) dentro de genes codificantes y genes no codificantes (p. Ej. TRNA, lncRNA, microRNA) en un solo nucleótido o de muy alta resolución.

Espectrometría de masas

La espectrometría de masas es una forma de cuantificar cualitativa y (relativamente) las modificaciones del ARN. La mayoría de las veces, las modificaciones provocan un aumento de masa para un nucleósido dado. Esto da una lectura característica para el nucleósido y la contraparte modificada. Además, la espectrometría de masas permite la investigación de la dinámica de modificación marcando moléculas de ARN con isótopos pesados ​​estables (no radiactivos) in vivo . Debido al aumento de masa definido de nucleósidos marcados con isótopos pesados, se pueden distinguir de sus respectivos isótopos no marcados mediante espectrometría de masas. Este método, llamado NAIL-MS (espectrometría de masas acoplada con marcado de isótopos de ácido nucleico), permite una variedad de enfoques para investigar la dinámica de modificación del ARN.

Tipos de ARN

Modificación del ARN mensajero

Recientemente, los experimentos funcionales han revelado muchas funciones funcionales novedosas de las modificaciones del ARN. La mayoría de las modificaciones de ARN se encuentran en ARN de transferencia y ARN ribosómico, pero también se ha demostrado que el ARNm eucariota se modifica con múltiples modificaciones diferentes. Hasta el día de hoy se han identificado aproximadamente diez modificaciones en el ARNm, de las cuales la N6-metiladenosina es la más abundante y estudiada. Las modificaciones del ARNm están vinculadas a muchas funciones en la célula. Aseguran la correcta maduración y función del ARNm, pero también actúan al mismo tiempo como parte del sistema inmunológico de la célula. Ciertas modificaciones como los nucleótidos 2'O-metilados se han asociado con la capacidad de las células para distinguir el ARNm propio del ARN extraño. Por ejemplo, se ha predicho que m 6 A afecta la traducción y localización de proteínas, la estabilidad del ARNm, la elección alternativa de poliA y la pluripotencia de las células madre. La pseudouridilación de codones sin sentido suprime la terminación de la traducción tanto in vitro como in vivo , lo que sugiere que la modificación del ARN puede proporcionar una nueva forma de expandir el código genético. La 5-metilcitosina, por otro lado, se ha asociado con el transporte de ARNm desde el núcleo al citoplasma y la mejora de la traducción. Estas funciones de m 5 C no se conocen ni están completamente probadas, pero un argumento sólido a favor de estas funciones en la célula es la localización observada de m 5 C en el sitio de inicio de la traducción. Es importante destacar que muchas enzimas de modificación están desreguladas y mutadas genéticamente en muchos tipos de enfermedades. Por ejemplo, las mutaciones genéticas en las pseudouridina sintasas causan miopatía mitocondrial, anemia sideroblástica (MLASA) y disqueratosis congénita.

En comparación con las modificaciones identificadas de otras especies de ARN como el ARNt y el ARNr, la cantidad de modificaciones identificadas en el ARNm es muy pequeña. Una de las principales razones por las que las modificaciones del ARNm no son tan conocidas es la falta de técnicas de investigación. Además de la falta de modificaciones identificadas, el conocimiento de las proteínas asociadas también está detrás de otras especies de ARN. Las modificaciones son el resultado de interacciones enzimáticas específicas con la molécula de ARN. Teniendo en cuenta las modificaciones del ARNm, la mayoría de las enzimas relacionadas conocidas son las enzimas escritoras que agregan la modificación al ARNm. Los grupos adicionales de lectores y borradores de enzimas son, para la mayoría de las modificaciones, poco conocidos o desconocidos en absoluto. Por estas razones, durante la última década ha habido un gran interés en estudiar estas modificaciones y su función.

Transferir modificaciones de ARN

El ARN de transferencia o ARNt es el tipo de ARN modificado más abundantemente. Las modificaciones en el ARNt juegan un papel crucial en el mantenimiento de la eficiencia de la traducción a través de la estructura de soporte, las interacciones anticodón-codón y las interacciones con las enzimas.

Las modificaciones de anticodón son importantes para la decodificación adecuada del ARNm. Dado que el código genético está degenerado, las modificaciones del anticodón son necesarias para decodificar correctamente el ARNm. En particular, la posición de oscilación del anticodón determina cómo se leen los codones. Por ejemplo, en eucariotas, una adenosina en la posición 34 del anticodón se puede convertir en inosina. La inosina es una modificación que puede emparejarse con citosina, adenina y uridina.

Otra base comúnmente modificada en el ARNt es la posición adyacente al anticodón. La posición 37 suele estar hipermodificada con modificaciones químicas voluminosas. Estas modificaciones previenen el cambio de marco y aumentan la estabilidad de unión del codón anticodón a través de interacciones de apilamiento.

Modificación del ARN ribosómico

Las modificaciones del ARN ribosómico se realizan a lo largo de la síntesis de ribosomas. Las modificaciones juegan principalmente un papel en la estructura del ARNr para proteger la eficiencia de traducción.

Tipos de cambios

Edición por inserción o eliminación

El efecto de la inserción de uracilo en las transcripciones de pre-ARNm

La edición de ARN mediante la adición y eliminación de uracilo se ha encontrado en cinetoplastos de las mitocondrias de Trypanosoma brucei . Debido a que esto puede involucrar una gran fracción de los sitios en un gen, a veces se le llama "edición panorámica" para distinguirlo de la edición tópica de uno o unos pocos sitios.

La edición panorámica comienza con el emparejamiento de bases de la transcripción primaria sin editar con un ARN guía (ARNg), que contiene secuencias complementarias a las regiones alrededor de los puntos de inserción / deleción. La región bicatenaria recién formada es luego envuelta por un editosoma, un gran complejo de múltiples proteínas que cataliza la edición. El editosoma abre la transcripción en el primer nucleótido no coincidente y comienza a insertar uridinas. Las uridinas insertadas se emparejarán con el ARN guía y la inserción continuará mientras haya A o G en el ARN guía y se detendrá cuando se encuentre una C o U. Los nucleótidos insertados provocan un cambio de marco y dan como resultado una proteína traducida que difiere de su gen.

El mecanismo del editosoma implica un corte endonucleolítico en el punto de desajuste entre el ARN guía y la transcripción sin editar. El siguiente paso es catalizado por una de las enzimas del complejo, una U-transferasa terminal, que agrega Us de UTP en el extremo 3 'del ARNm. Los extremos abiertos se mantienen en su lugar mediante otras proteínas del complejo. Otra enzima, una exoribonucleasa específica de U, elimina el Us no apareado. Después de que la edición ha hecho que el ARNm sea complementario del ARNg, una ligasa de ARN vuelve a unir los extremos de la transcripción de ARNm editada. Como consecuencia, el editosoma puede editar solo en una dirección de 3 'a 5' a lo largo de la transcripción del ARN primario. El complejo puede actuar sobre un solo ARN guía a la vez. Por lo tanto, una transcripción de ARN que requiera una edición extensa necesitará más de un complejo de ARN guía y editosoma.

Edición por desaminación

Edición de C a U

El efecto de la edición de ARN de C a U en el gen ApoB humano

La edición implica citidina desaminasa que desamina una base de citidina en una base de uridina. Un ejemplo de edición de C a U es con el gen de la apolipoproteína B en humanos. La apo B100 se expresa en el hígado y la apo B48 se expresa en los intestinos. En los intestinos, el ARNm tiene una secuencia CAA editada para ser UAA, un codón de terminación, produciendo así la forma B48 más corta. La edición de C a U a menudo ocurre en el ARN mitocondrial de plantas con flores. Las diferentes plantas tienen diferentes grados de edición de C a U; por ejemplo, ocho eventos de edición ocurren en las mitocondrias del musgo Funaria hygrometrica , mientras que más de 1.700 eventos de edición ocurren en los lycophytes Isoetes engelmanii . La edición de C a U es realizada por miembros de la familia de proteínas de repetición pentatricopeptídica (PPR). Las angiospermas tienen grandes familias de PPR, que actúan como factores trans para los elementos cis que carecen de una secuencia de consenso; Arabidopsis tiene alrededor de 450 miembros en su familia PPR. Ha habido una serie de descubrimientos de proteínas PPR tanto en plastidios como en mitocondrias.

Edición de la A a la I

Las modificaciones de adenosina a inosina (A a I) contribuyen a casi el 90% de todos los eventos de edición en el ARN. La desaminación de la adenosina es catalizada por la adenosina desaminasa específica de ARN bicatenario ( ADAR ), que normalmente actúa sobre los pre-ARNm. La desaminación de adenosina a inosina altera y desestabiliza el emparejamiento de bases de dsRNA, lo que hace que ese dsRNA particular sea menos capaz de producir siRNA , lo que interfiere con la vía del RNAi .

El apareamiento de bases oscilantes hace que el ARN desaminado tenga una estructura única pero diferente, que puede estar relacionada con la inhibición del paso de inicio de la traducción del ARN. Los estudios han demostrado que el I-ARN (ARN con muchas repeticiones del par de bases IU) recluta metilasas que están involucradas en la formación de heterocromatina y que esta modificación química interfiere en gran medida con los sitios diana de miARN. Existe una investigación activa sobre la importancia de las modificaciones A-to-I y su propósito en el novedoso concepto de epitranscriptómica , en el que se realizan modificaciones al ARN que alteran su función. Una consecuencia establecida desde hace mucho tiempo de A-a-I en el ARNm es la interpretación de I como una G, lo que conduce a la sustitución funcional de A-a-G, por ejemplo, en la interpretación del código genético por ribosomas. Sin embargo, estudios más recientes han debilitado esta correlación al mostrar que los I también pueden ser decodificados por el ribosoma (aunque en menor medida) como A y U. Además, se demostró que los I conducen al estancamiento de los ribosomas en el ARNm rico en I.

El desarrollo de la secuenciación de alto rendimiento en los últimos años ha permitido el desarrollo de extensas bases de datos para diferentes modificaciones y ediciones de ARN. RADAR (Base de datos rigurosamente anotada de edición de ARN A-to-I) se desarrolló en 2013 para catalogar la gran variedad de sitios A-to-I y niveles específicos de tejido presentes en humanos, cerdos, ratones y moscas . La adición de sitios novedosos y las ediciones generales a la base de datos están en curso. El nivel de edición para sitios de edición específicos, por ejemplo, en la transcripción de filamina A, es específico de tejido. La eficiencia del empalme de ARNm es un factor importante que controla el nivel de edición de ARN de A a I. Curiosamente, ADAR1 y ADAR2 también afectan el empalme alternativo a través de la capacidad de edición de A-to-I y la capacidad de unión de dsRNA.

Edición alternativa de ARNm

La edición alternativa de ARNm de U-a-C se informó por primera vez en las transcripciones de WT1 (Wilms Tumor-1), y se observaron por primera vez cambios de ARNm de GA no clásicos en las transcripciones de HNRNPK (ribonucleoproteína K nuclear heterogénea) en muestras colorrectales tanto malignas como normales. Los últimos cambios también se observaron más tarde junto con alteraciones no clásicas de U-a-C en las transcripciones de TPH2 (triptófano hidroxilasa 2) de células cerebrales . Aunque la aminación inversa podría ser la explicación más simple para los cambios U-to-C, se han propuesto mecanismos de transaminación y transglicosilación para eventos de edición U-to-C de plantas en las transcripciones mitocondriales. Un estudio reciente informó nuevos cambios de ARNm de G-a-A en las transcripciones de WT1 en dos puntos calientes, proponiendo la APOBEC3A (enzima de edición de ARNm de apolipoproteína B, polipéptido catalítico 3A) como la enzima implicada en esta clase de edición de ARNm alternativa. También se demostró que los cambios de ARNm alternativos se asociaron con variantes de corte y empalme de WT1 canónicas , lo que indica su importancia funcional.

Edición de ARN en mitocondrias y plastidios de plantas

Se ha demostrado en estudios previos que los únicos tipos de edición de ARN que se ven en las mitocondrias y plastidios de las plantas son la conversión de C a U y U a C (muy raro). Los sitios de edición de ARN se encuentran principalmente en las regiones codificantes de ARNm, intrones y otras regiones no traducidas. De hecho, la edición de ARN puede restaurar la funcionalidad de las moléculas de ARNt. Los sitios de edición se encuentran principalmente aguas arriba de los ARN de plastidios o mitocondrias. Si bien las posiciones específicas para los eventos de edición de ARN de C a U se han estudiado bastante bien tanto en la mitocondria como en el plastidio, aún no se ha establecido la identidad y organización de todas las proteínas que comprenden el editosoma. Se ha demostrado que los miembros de la familia de proteínas expansivas PPR funcionan como factores de acción trans para el reconocimiento de secuencias de ARN. También se requieren miembros específicos de la familia MORF (factor de edición de ARN de organelos múltiples) para una correcta edición en varios sitios. Como se ha demostrado que algunas de estas proteínas MORF interactúan con miembros de la familia PPR, es posible que las proteínas MORF sean componentes del complejo editosoma. Una enzima responsable de la transcripción o desaminación de la transcripción de ARN sigue siendo difícil de alcanzar, aunque se ha propuesto que las proteínas PPR también pueden cumplir esta función.

La edición de ARN es esencial para el funcionamiento normal de la actividad de traducción y respiración de la planta. La edición puede restaurar las secuencias de apareamiento de bases esenciales de los ARNt, restaurando la funcionalidad. También se ha relacionado con la producción de proteínas editadas con ARN que se incorporan a los complejos polipeptídicos de la vía respiratoria. Por lo tanto, es muy probable que los polipéptidos sintetizados a partir de ARN no editados no funcionen correctamente y obstaculicen la actividad tanto de las mitocondrias como de los plástidos.

La edición de ARN de C a U puede crear codones de inicio y parada , pero no puede destruir los codones de inicio y parada existentes. Se crea un codón de inicio críptico cuando el codón ACG se edita para que sea AUG.

Resumen de las diversas funciones de la edición de ARN

Edición de ARN en virus

Se ha demostrado que los virus (es decir, el sarampión , las paperas o la parainfluenza ), especialmente los virus que tienen un genoma de ARN, han evolucionado para utilizar modificaciones de ARN de muchas formas cuando se apoderan de la célula huésped. Se sabe que los virus utilizan las modificaciones del ARN en diferentes partes de su ciclo de infección, desde la evasión inmune hasta la mejora de la traducción de proteínas. La edición de ARN se utiliza para la estabilidad y generación de variantes de proteínas. Los ARN virales son transcritos por una ARN polimerasa dependiente de ARN codificada por virus , que es propensa a pausar y "tartamudear" en ciertas combinaciones de nucleótidos. Además, la polimerasa agrega hasta varios cientos de A sin plantilla en el extremo 3 'del ARNm naciente. Estos A ayudan a estabilizar el ARNm. Además, la pausa y el tartamudeo de la ARN polimerasa permite la incorporación de uno o dos G o As cadena arriba del codón de traducción. La adición de nucleótidos sin plantilla cambia el marco de lectura, lo que genera una proteína diferente.

Además, se ha demostrado que las modificaciones del ARN tienen efectos tanto positivos como negativos sobre la eficacia de la replicación y la traducción en función del virus. Por ejemplo, Courtney et al. mostró que una modificación de ARN llamada 5-metilcitosina se agrega al ARNm viral en las células huésped infectadas con el fin de mejorar la traducción de proteínas del virus VIH-1. La inhibición de la modificación de m 5 C en el ARNm viral da como resultado una reducción significativa en la traducción de la proteína viral, pero curiosamente no tiene ningún efecto sobre la expresión de los ARNm virales en la célula. Por otro lado, Lichinchi et al. mostró que la modificación de N6-metiladenosina en el ARNm de ZIKV inhibe la replicación viral.

Origen y evolución de la edición de ARN

El sistema de edición de ARN observado en el animal puede haber evolucionado a partir de mononucleótidos desaminasas, lo que ha dado lugar a familias de genes más grandes que incluyen los genes apobec-1 y adar. Estos genes comparten una identidad cercana con las desaminasas bacterianas involucradas en el metabolismo de los nucleótidos. La adenosina desaminasa de E. coli no puede desaminar un nucleósido en el ARN; La bolsa de reacción de la enzima es demasiado pequeña para que la hebra de ARN se una. Sin embargo, este sitio activo se ensancha por cambios de aminoácidos en los genes análogos humanos correspondientes, APOBEC1 y ADAR , lo que permite la desaminación. La panedición mediada por gRNA en las mitocondrias del tripanosoma , que implica la inserción de una plantilla de residuos U, es una reacción bioquímica completamente diferente. En otros estudios se ha demostrado que las enzimas implicadas se han obtenido y adaptado de diferentes fuentes. Pero la especificidad de la inserción de nucleótidos a través de la interacción entre el ARNg y el ARNm es similar a los procesos de edición del ARNt en las mitocondrias de animales y de Acanthamoeba . La metilación eucariota de ribosa de ARNr por moléculas de ARN guía es una forma similar de modificación.

Por lo tanto, la edición de ARN evolucionó más de una vez. Se han sugerido varios fundamentos adaptativos para la edición. La edición se describe a menudo como un mecanismo de corrección o reparación para compensar defectos en las secuencias de genes. Sin embargo, en el caso de la edición mediada por gRNA, esta explicación no parece posible porque si ocurre un defecto primero, no hay forma de generar una región que codifique gRNA sin errores, que presumiblemente surge por duplicación de la región del gen original. Este pensamiento conduce a una propuesta evolutiva denominada "evolución constructiva neutral" en la que se invierte el orden de los pasos, con la capacidad gratuita de edición antecediendo al "defecto". 31

La edición de ARN puede estar involucrada en la degradación del ARN

Un estudio analizó la participación de la edición de ARN en la degradación del ARN. Los investigadores observaron específicamente la interacción entre ADAR y UPF1 , una enzima involucrada en la vía de desintegración del ARNm mediada sin sentido (NMD). Descubrieron que ADAR y UPF1 se encuentran dentro del suprasliceosoma y forman un complejo que conduce a la regulación a la baja de genes específicos. El mecanismo exacto o las vías exactas en las que estos dos están involucrados se desconocen en este momento. El único hecho que ha demostrado esta investigación es que forman genes específicos complejos y regulados a la baja.

Edición terapéutica de ARNm

La dirección de ediciones para corregir secuencias mutadas se propuso y demostró por primera vez en 1995. Este trabajo inicial utilizó oligonucleótidos antisentido de ARN sintético complementarios a una mutación prematura del codón de terminación en una secuencia de distrofina para activar la edición A-to-I del codón de terminación a una lectura a través del codón en un sistema celular modelo xenopus. Si bien esto también condujo a transiciones cercanas inadvertidas de A a I, las transiciones de A a I (leídas como G) pueden corregir los tres codones de terminación, pero no pueden crear un codón de terminación. Por lo tanto, los cambios llevaron a una corrección> 25% del codón de terminación objetivo con lectura hasta una secuencia indicadora de luciferasa cadena abajo. El trabajo de seguimiento de Rosenthal logró la edición de la secuencia de ARNm mutado en cultivo de células de mamíferos al dirigir un oligonucleótido unido a una citidina desaminasa para corregir una secuencia de fibrosis quística mutada. Más recientemente, CRISPR-Cas13 fusionado a desaminasas se ha empleado para dirigir la edición de ARNm.

Comparación con la edición de ADN

A diferencia de la edición de ADN, que es permanente, los efectos de la edición de ARN, incluidas las posibles mutaciones fuera del objetivo en el ARN, son transitorios y no se heredan. Por tanto, la edición de ARN se considera menos riesgosa. Además, es posible que solo requiera un ARN guía mediante el uso de la proteína ADAR que ya se encuentra en humanos y muchas otras células eucariotas en lugar de tener que introducir una proteína extraña en el cuerpo.

Referencias