Secuenciación de polony - Polony sequencing

La secuenciación de polony es una técnica de secuenciación multiplex económica pero muy precisa que se puede utilizar para "leer" millones de secuencias de ADN inmovilizadas en paralelo. Esta técnica fue desarrollada por primera vez por el grupo del Dr. George Church en la Escuela de Medicina de Harvard . A diferencia de otras técnicas de secuenciación, la tecnología de secuenciación de Polony es una plataforma abierta con software y protocolos de código abierto que se pueden descargar gratuitamente. Además, el hardware de esta técnica se puede configurar fácilmente con una microscopía de epifluorescencia comúnmente disponible y un sistema de fluidos / celda de flujo controlado por computadora. La secuenciación de polony se realiza generalmente en una biblioteca de etiquetas de extremos emparejados en la que cada molécula de plantilla de ADN tiene una longitud de 135 pb con dos etiquetas genómicas apareadas de 17-18 pb separadas y flanqueadas por secuencias comunes. La longitud de lectura actual de esta técnica es de 26 bases por amplicón y 13 bases por etiqueta, dejando un espacio de 4 a 5 bases en cada etiqueta.

Flujo de trabajo

Un procedimiento ilustrado para la secuenciación de Polony

El protocolo de secuenciación de Polony se puede dividir en tres partes principales, que son la construcción de la biblioteca de etiquetas finales emparejadas, la amplificación de la plantilla y la secuenciación del ADN.

Construcción de bibliotecas de etiquetas finales emparejadas

Este protocolo comienza cortando aleatoriamente el ADN genómico probado en una distribución de tamaño ajustada. A continuación, las moléculas de ADN cortadas se someten a la reparación del extremo y al tratamiento de cola A. El tratamiento de reparación de extremos convierte los extremos del ADN que sobresalen dañados o incompatibles en ADN fosforilado en 5 'y de extremos romos, lo que permite la ligadura inmediata de los extremos romos, mientras que el tratamiento de cola A agrega una A al extremo 3' del ADN cortado. Las moléculas de ADN con una longitud de 1 kb se seleccionan cargándolas en el gel TBE PAGE al 6%. En el siguiente paso, las moléculas de ADN se circularizan con oligonucleótidos sintéticos de cola en T de 30 pb de largo (T30), que contienen dos sitios de reconocimiento de MmeI que miran hacia afuera, y el ADN circularizado resultante experimenta una replicación en círculo rodante . Las moléculas de ADN circularizado amplificado luego se digieren con MmeI (endonucleasa de restricción de tipo II) que corta a una distancia de su sitio de reconocimiento, liberando el fragmento T30 flanqueado por etiquetas de 17-18 pb (aproximadamente 70 pb de longitud). Las moléculas de etiqueta emparejada deben repararse en los extremos antes de la ligación de los oligonucleótidos cebadores de ePCR (PCR en emulsión) (FDV2 y RDV2) en ambos extremos. Las moléculas de la biblioteca de 135 pb resultantes se seleccionan por tamaño y se traducen por mellas . Por último, amplifique las moléculas de la biblioteca de etiquetas finales emparejadas de 135 pb con PCR para aumentar la cantidad de material de la biblioteca y eliminar los productos de ligadura extraños en un solo paso. La plantilla de ADN resultante consta de una secuencia de FDV de 44 pb, una etiqueta proximal de 17-18 pb, la secuencia T30, una etiqueta distal de 17-18 pb y una secuencia de RDV de 25 pb.

Amplificación de plantilla

PCR en emulsión

Las perlas recubiertas de estreptavidina paramagnética de tamaño único están precargadas con un cebador directo de biotina doble. La estreptavidina tiene una afinidad muy fuerte por la biotina , por lo que el cebador directo se unirá firmemente a la superficie de las perlas. A continuación, se prepara una fase acuosa con las perlas precargadas, la mezcla de PCR, los cebadores directos e inversos y la biblioteca de etiquetas finales emparejadas. Esto se mezcla y se agita con una fase oleosa para crear la emulsión. Idealmente, cada gota de agua en la emulsión de aceite tiene una perla y una molécula de ADN molde, lo que permite millones de amplificación sin interacción dentro de un volumen a escala de mililitros mediante la realización de PCR.

Rotura de emulsión

Después de la amplificación, la emulsión del paso anterior se rompe con isopropanol y tampón detergente (Tris 10 mM pH 7,5, EDTA 1 mM pH 8,0, NaCl 100 mM, Triton X ‐ 100 al 1% (v / v), 1% (p / v) ) SDS), seguida de una serie de vórtex, centrifugación y separación magnética. La solución resultante es una suspensión de perlas vacías, clonales y no clonales, que surgen de gotitas de emulsión que inicialmente tienen cero, una o múltiples moléculas de plantilla de ADN, respectivamente. La perla amplificada podría enriquecerse en el siguiente paso.

Enriquecimiento de perlas

El enriquecimiento de las perlas amplificadas se logra mediante la hibridación con perlas de poliestireno no magnéticas de baja densidad más grandes que se cargan previamente con oligonucleótidos de captura biotinilados (secuencia de ADN que complementa la secuencia de amplicones de ePCR). A continuación, la mezcla se centrifuga para separar el complejo de perlas amplificadas y de captura de las perlas no amplificadas. El complejo de perlas de captura amplificado tiene una densidad más baja y, por lo tanto, permanecerá en el sobrenadante mientras que las perlas sin amplificar forman un sedimento. El sobrenadante se recupera y se trata con NaOH que romperá el complejo. Las perlas amplificadas paramagnéticas se separan de las perlas de captura no magnéticas mediante separación magnética. Este protocolo de enriquecimiento es capaz de enriquecer cinco veces las perlas amplificadas.

Tapado de cuentas

El propósito de la protección de perlas es unir un oligonucleótido de “protección” al extremo 3 'de los cebadores de ePCR directo no extendidos y el segmento RDV del ADN molde. La tapa que se está utilizando es un grupo amino que evita que las sondas fluorescentes se liguen a estos extremos y, al mismo tiempo, ayuda al posterior acoplamiento del ADN molde al cubreobjetos de la celda de flujo aminosilanado.

Arreglo de cubreobjetos

En primer lugar, los cubreobjetos se lavan y se tratan con aminosilano, lo que permite el posterior acoplamiento covalente del ADN molde y elimina cualquier contaminación fluorescente. Las perlas enriquecidas y amplificadas se mezclan con acrilamida y se vierten en un molde poco profundo formado por un portaobjetos de microscopio con máscara de teflón . Inmediatamente, coloque el cubreobjetos tratado con aminosilano sobre el gel de acrilamida y deje que polimerice durante 45 minutos. A continuación, invierta la pila de portaobjetos / cubreobjetos y retire el portaobjetos del microscopio del gel. Los cubreobjetos tratados con silano se unirán covalentemente al gel, mientras que el teflón en la superficie del portaobjetos del microscopio permitirá una mejor extracción del portaobjetos del gel de acrilamida. Luego, los cubreobjetos se unirán al cuerpo de la celda de flujo y se quitarán las perlas sueltas.

secuencia ADN

La bioquímica de la secuenciación de Polony se basa principalmente en las capacidades discriminatorias de ligasas y polimerasas. En primer lugar, se hace fluir una serie de cebadores de anclaje a través de las células y se hibridan con las secuencias de oligonucleótidos sintéticos en el extremo 3 'o 5' inmediato de las etiquetas de ADN genómico proximal o distal de 17-18 pb. A continuación, se realiza una reacción de ligación enzimática del cebador de anclaje a una población de nonámeros degenerados que están marcados con tintes fluorescentes.
Nonámeros etiquetados diferencialmente: 

	5' Cy5‐NNNNNNNNT

	5' Cy3‐NNNNNNNNA

	5' TexasRed‐NNNNNNNNC

	5' 6FAM‐NNNNNNNNG

Los nonámeros marcados con fluoróforos se hibridan con éxito diferencial con las secuencias marcadoras de acuerdo con una estrategia similar a la de los cebadores degenerados , pero en lugar de someterse a polimerasas, los nonámeros se ligan selectivamente al ADN adyacente, el cebador de anclaje. La fijación de la molécula de fluoróforo proporciona una señal fluorescente que indica si hay una A, C, G o T en la posición de consulta en la etiqueta de ADN genómico. Después de la obtención de imágenes de cuatro colores, los complejos de cebador de anclaje / nonamer se eliminan y se inicia un nuevo ciclo reemplazando el cebador de anclaje. Se introduce una nueva mezcla de nonámeros marcados con fluorescencia, para lo cual la posición de la consulta se desplaza una base más en la etiqueta de ADN genómico. 

	5' Cy5‐NNNNNNNTN

	5' Cy3‐NNNNNNNAN

	5' TexasRed‐NNNNNNNCN

	5' 6FAM‐NNNNNNNGN

Siete bases de la dirección de 5 'a 3' y seis bases del extremo de 3 'podrían consultarse de esta manera. El resultado final es una longitud de lectura de 26 bases por ejecución (13 bases de cada una de las etiquetas emparejadas) con un espacio de 4 a 5 bases en el medio de cada etiqueta.

Análisis y software

La secuenciación polonia genera millones de 26 lecturas por ejecución y esta información necesitaba normalizarse y convertirse en secuencia. Esto se puede realizar con el software desarrollado por Church Lab. Todo el software es gratuito y se puede descargar desde el sitio web.

Instrumentos

El instrumento de secuenciación utilizado en esta técnica podría configurarse mediante el microscopio de fluorescencia comúnmente disponible y una celda de flujo controlada por computadora. Los instrumentos necesarios costaron alrededor de 130 000 dólares estadounidenses en 2005. En 2009 se desarrolló una máquina de secuenciación de polonia dedicada, Polonator , que Dover vendió a 170 000 dólares estadounidenses . Incluía software, reactivos y protocolos de código abierto y estaba destinado a ser utilizado en el Proyecto Genoma Personal .

Fortalezas y debilidades

La secuenciación de polony permite un alto rendimiento y una alta precisión de consenso de la secuenciación de ADN basada en un instrumento económico y comúnmente disponible. Además, es una técnica muy flexible que permite una aplicación variable, incluida la resecuenciación de BAC (cromosoma artificial bacteriano) y del genoma bacteriano, así como la secuenciación de etiquetas y códigos de barras SAGE (análisis en serie de la expresión génica). Además, se enfatiza la técnica de secuenciación polonia como un sistema abierto que comparte todo, incluido el software desarrollado, el protocolo y los reactivos.

Sin embargo, aunque la adquisición de datos sin procesar podría alcanzarse hasta en 786 gigabits, solo es útil 1 bit de información de cada 10.000 bits recopilados. Otro desafío de esta técnica es la uniformidad de la amplificación relativa de los objetivos individuales. La amplificación no uniforme podría reducir la eficiencia de la secuenciación y aparecer como el mayor obstáculo en esta técnica.

Historia

La secuenciación polony es un desarrollo de la tecnología polony de finales de la década de 1990 y de la década de 2000. En 2003 se desarrollaron métodos para secuenciar polonías in situ utilizando una extensión de base única que podría lograr lecturas de 5-6 bases. En 2005, estos primeros intentos se habían revisado para desarrollar la tecnología de secuenciación polonia existente. Los conceptos de secuenciación por ligadura altamente paralelos de la secuenciación polonia han contribuido a la base para tecnologías de secuenciación posteriores como la secuenciación sólida ABI .

Referencias

enlaces externos