Amplificación de sonda dependiente de la ligadura multiplex - Multiplex ligation-dependent probe amplification

La amplificación de sonda dependiente de la ligadura múltiple ( MLPA ) es una variación de la reacción en cadena de la polimerasa múltiple que permite la amplificación de múltiples dianas con un solo par de cebadores . Detecta cambios en el número de copias a nivel molecular y se utilizan programas de software para el análisis. La identificación de deleciones o duplicaciones puede indicar mutaciones patogénicas, por lo que MLPA es una importante herramienta de diagnóstico utilizada en los laboratorios de patología clínica de todo el mundo.

Historia

Jan Schouten , un científico holandés, inventó la amplificación de la sonda dependiente de la ligadura múltiple . El método se describió por primera vez en 2002 en la revista científica Nucleic Acid Research . Las primeras aplicaciones incluyeron la detección de deleciones de exones en los genes humanos BRCA1 , MSH2 y MLH1 , que están relacionados con el cáncer de mama y colon hereditario. Ahora MLPA se utiliza para detectar cientos de trastornos hereditarios, así como para la elaboración de perfiles de tumores.

Descripción

Ejemplo de exón deleciones detectado por Multiplex amplificación de sonda dependiente de ligación en una distrofia muscular de Duchenne paciente

MLPA cuantifica la presencia de secuencias particulares en una muestra de ADN, utilizando un par de sondas especialmente diseñadas para cada secuencia diana de interés. El proceso consta de varios pasos:

  1. El ADN de la muestra se desnaturaliza , lo que da como resultado un ADN de muestra monocatenario.
  2. Los pares de sondas se hibridan con la muestra de ADN, y cada par de sondas se diseña para consultar la presencia de una secuencia de ADN particular.
  3. La ligasa se aplica al ADN hibridado, combinando pares de sondas que se hibridan inmediatamente uno al lado del otro en una sola hebra de ADN que puede amplificarse mediante PCR.
  4. La PCR amplifica todos los pares de sondas que se han ligado con éxito, utilizando cebadores de PCR marcados con fluorescencia.
  5. Los productos de la PCR se cuantifican, normalmente mediante electroforesis (capilar) .

Cada par de sondas consta de dos oligonucleótidos, con una secuencia que reconoce sitios adyacentes del ADN diana , un sitio de cebado de PCR y, opcionalmente, un "relleno" para dar al producto de PCR una longitud única en comparación con otros pares de sondas en el ensayo MLPA. Cada par de sondas completo debe tener una longitud única, de modo que sus amplicones resultantes puedan identificarse de forma única durante la cuantificación, evitando las limitaciones de resolución de la PCR multiplex . Debido a que el cebador directo utilizado para la amplificación de la sonda está marcado con fluorescencia , cada amplicón genera un pico fluorescente que puede detectarse mediante un secuenciador capilar. Comparando el patrón de pico obtenido en una muestra dada con el obtenido en varias muestras de referencia, se puede determinar la cantidad relativa de cada amplicón. Esta proporción es una medida de la proporción en la que la secuencia diana está presente en el ADN de la muestra.

Varias técnicas que incluyen DGGE ( electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante ), DHPLC ( cromatografía líquida de alto rendimiento desnaturalizante ) y SSCA (análisis de conformación de una sola hebra) identifican eficazmente SNP y pequeñas inserciones y deleciones. MLPA, sin embargo, es una de las únicas técnicas precisas y eficientes en el tiempo para detectar deleciones e inserciones genómicas (uno o más exones completos), que son causas frecuentes de cánceres como el cáncer colorrectal hereditario sin poliposis ( HNPCC ), mama y cáncer de ovarios. MLPA puede determinar con éxito y fácilmente el número relativo de copias de todos los exones dentro de un gen simultáneamente con alta sensibilidad.

Ploidía relativa

Un uso importante de MLPA es determinar la ploidía relativa . Por ejemplo, las sondas pueden diseñarse para dirigirse a diversas regiones del cromosoma 21 de una célula humana. Las intensidades de la señal de las sondas se comparan con las obtenidas de una muestra de ADN de referencia que se sabe que tiene dos copias del cromosoma. Si hay una copia adicional en la muestra de prueba, se espera que las señales sean 1,5 veces las intensidades de las respectivas sondas de la referencia. Si solo hay una copia, se espera que la proporción sea de 0,5. Si la muestra tiene dos copias, se espera que las intensidades relativas de la sonda sean iguales.

Análisis de cociente de dosis

El análisis del cociente de dosis es el método habitual para interpretar los datos de MLPA. Si ayb son las señales de dos amplicones en la muestra del paciente, y A y B son los amplicones correspondientes en el control experimental, entonces el cociente de dosis DQ = (a / b) / (A / B). Aunque los cocientes de dosificación pueden calcularse para cualquier par de amplicones, suele darse el caso de que uno de los pares sea una sonda de referencia interna.

Aplicaciones

MLPA facilita la amplificación y detección de múltiples objetivos con un solo par de cebadores. En una reacción de PCR multiplex estándar, cada fragmento necesita un par de cebadores amplificadores únicos. La presencia de estos cebadores en una gran cantidad da lugar a diversos problemas, como la dimerización y el cebado falso. Con MLPA, se puede lograr la amplificación de las sondas. Por tanto, se pueden amplificar y cuantificar muchas secuencias (hasta 40) utilizando un solo par de cebadores. La reacción de MLPA es rápida, económica y muy sencilla de realizar.

MLPA tiene una variedad de aplicaciones que incluyen detección de mutaciones y polimorfismos de un solo nucleótido , análisis de metilación del ADN , cuantificación relativa del ARNm , caracterización cromosómica de líneas celulares y muestras de tejido, detección del número de copias de genes, detección de duplicaciones y deleciones en genes de predisposición al cáncer humano como BRCA1 , BRCA2 , hMLH1 y hMSH2 y determinación de aneuploidía . MLPA tiene una aplicación potencial en el diagnóstico prenatal tanto invasivo como no invasivo .

Estudios recientes han demostrado que MLPA (así como otras variantes como iMLPA) es una técnica robusta para la caracterización de la inversión.

Variantes

iMLPA

Diferencias entre MLPA e iMLPA

Giner-Delgado, Carla, et al. describió una variante de MLPA combinándola con iPCR. Llaman a estos nuevos métodos iMLPA y su procedimiento es el mismo que MLPA pero son necesarios dos pasos adicionales al principio:

  1. Primero, es necesario un tratamiento de ADN con enzimas de restricción que corten a ambos lados de la región de interés.
  2. Los fragmentos obtenidos de la digestión se recircularizan y enlazan

El diseño de la sonda es bastante similar. Cada sonda estará formada por dos partes que tienen al menos: una secuencia diana , que es una región que contiene la secuencia complementaria a la región de interés, para que se pueda producir la correcta hibridación. Y una secuencia de cebadores al final, es una secuencia cuyo diseño varía y es la que permitirá el diseño de cebadores y posterior amplificación de fragmentos. Además, una de las partes de la sonda normalmente contiene un relleno entre la secuencia objetivo y la secuencia del cebador. El uso de diferentes rellenadores permite la identificación de sondas con las mismas secuencias de cebadores pero diferentes secuencias diana, lo que es clave para la amplificación múltiple de varios fragmentos diferentes en una sola reacción.

El siguiente paso continúa con el protocolo MLPA típico.

Referencias

enlaces externos