Secuenciación de Maxam-Gilbert - Maxam–Gilbert sequencing
La secuenciación de Maxam-Gilbert es un método de secuenciación de ADN desarrollado por Allan Maxam y Walter Gilbert en 1976-1977. Este método se basa en la modificación química parcial del ADN específica de la nucleobase y la posterior escisión del esqueleto del ADN en sitios adyacentes a los nucleótidos modificados .
La secuenciación de Maxam-Gilbert fue el primer método ampliamente adoptado para la secuenciación de ADN y, junto con el método didesoxi de Sanger , representa la primera generación de métodos de secuenciación de ADN. La secuenciación Maxam-Gilbert ya no se usa ampliamente, ya que ha sido reemplazada por métodos de secuenciación de próxima generación .
Historia
Aunque Maxam y Gilbert publicaron su método de secuenciación química dos años después de que Frederick Sanger y Alan Coulson publicaran su trabajo sobre secuenciación más-menos, la secuenciación de Maxam-Gilbert rápidamente se hizo más popular, ya que el ADN purificado podía usarse directamente, mientras que el método inicial de Sanger requería que cada inicio de lectura se clonará para la producción de ADN monocatenario. Sin embargo, con la mejora del método de terminación de cadena (ver más abajo), la secuenciación de Maxam-Gilbert ha caído en desgracia debido a su complejidad técnica que prohíbe su uso en kits de biología molecular estándar, el uso extensivo de productos químicos peligrosos y las dificultades con la escala. hasta.
El artículo de 1977 de Allan Maxam y Walter Gilbert "Un nuevo método para secuenciar el ADN" fue galardonado con un premio Citation for Chemical Breakthrough Award de la División de Historia de la Química de la Sociedad Química Estadounidense de 2017. Fue presentado al Departamento de Biología Molecular y Celular , Universidad Harvard.
Procedimiento
La secuenciación de Maxam-Gilbert requiere el marcaje radiactivo en un extremo 5 ' del fragmento de ADN que se va a secuenciar (generalmente mediante una reacción de quinasa usando gamma- 32 P ATP ) y la purificación del ADN. El tratamiento químico genera rupturas en una pequeña proporción de una o dos de las cuatro bases de nucleótidos en cada una de las cuatro reacciones (G, A + G, C, C + T). Por ejemplo, las purinas (A + G) se depurizan con ácido fórmico , las guaninas (y en cierta medida las adeninas ) se metilan con dimetilsulfato y las pirimidinas (C + T) se hidrolizan con hidrazina . La adición de sal ( cloruro de sodio ) a la reacción de hidracina inhibe la reacción de timina para la reacción de solo C. A continuación, los ADN modificados pueden escindirse mediante piperidina caliente ; (CH 2 ) 5 NH en la posición de la base modificada. La concentración de los químicos modificadores se controla para introducir en promedio una modificación por molécula de ADN. Por tanto, se genera una serie de fragmentos marcados, desde el extremo radiomarcado hasta el primer sitio de "corte" en cada molécula.
Los fragmentos de las cuatro reacciones se someten a electroforesis uno al lado del otro en geles de acrilamida desnaturalizantes para la separación por tamaños. Para visualizar los fragmentos, el gel se expone a una película de rayos X para autorradiografía , produciendo una serie de bandas oscuras, cada una de las cuales muestra la ubicación de moléculas de ADN radiomarcadas idénticas. De la presencia y ausencia de ciertos fragmentos se puede inferir la secuencia.
Métodos relacionados
Este método condujo al Ensayo de interferencia de metilación, que se utiliza para mapear los sitios de unión al ADN para las proteínas que se unen al ADN .
En 1994 se desarrolló un protocolo de secuenciación automatizado Maxam-Gilbert.