Secuenciación de firmas masivamente paralela - Massively parallel signature sequencing

La secuenciación masiva de firmas paralelas ( MPSS ) es un procedimiento que se utiliza para identificar y cuantificar las transcripciones de ARNm , lo que da como resultado datos similares al análisis en serie de la expresión génica (SAGE), aunque emplea una serie de pasos bioquímicos y de secuenciación que son sustancialmente diferentes.

Cómo funciona

MPSS es un método para determinar los niveles de expresión de ARNm contando el número de moléculas de ARNm individuales producidas por cada gen. Tiene un "final abierto" en el sentido de que la identidad de los ARN que se van a medir no está predeterminada, como ocurre con los microarrays de expresión génica .

Una muestra de ARNm se convierte primero en ADN complementario ( ADNc ) mediante transcriptasa inversa , lo que facilita las manipulaciones posteriores. Estos ADNc se fusionan con una pequeña "etiqueta" de oligonucleótidos que permite que el ADNc se amplifique por PCR y luego se acople a microperlas. Después de varias rondas de determinación de la secuencia, mediante la hibridación de sondas marcadas con fluorescencia, se determina una firma de secuencia de ~ 16-20 pb de cada cuenta. Las imágenes fluorescentes capturan la señal de todas las perlas, mientras están fijadas a una superficie bidimensional, por lo que las secuencias de ADN se determinan a partir de todas las perlas en paralelo. Existe cierta amplificación del material de partida, por lo que, al final, se obtienen aproximadamente 1.000.000 de lecturas de secuencia por experimento.

Descripción general

MPSS permite que las transcripciones de ARNm se identifiquen mediante la generación de una secuencia de firma de 17-20 pb ( par de bases ) adyacente al extremo 3 'del sitio más 3' de la enzima de restricción designada (comúnmente Sau3A o DpnII ). Cada secuencia de firma se clona en una entre un millón de microperlas . La técnica asegura que solo un tipo de secuencia de ADN esté en una microperla. Entonces, si hay 50 copias de una transcripción específica en la muestra biológica, estas transcripciones se capturarán en 50 microperlas diferentes, cada cuenta con aproximadamente 100,000 copias amplificadas de la secuencia de firma específica. A continuación, las microperlas se colocan en una celda de flujo para su secuenciación y cuantificación. Las firmas de secuencia se descifran mediante la identificación paralela de cuatro bases mediante hibridación con codificadores marcados con fluorescencia (Figura 5). Cada uno de los codificadores tiene una etiqueta única que se detecta después de la hibridación tomando una imagen de la matriz de microperlas. El siguiente paso es escindir y eliminar ese conjunto de cuatro bases y revelar las siguientes cuatro bases para una nueva ronda de hibridación de codificadores y adquisición de imágenes. La salida sin procesar es una lista de secuencias de firma de 17 a 20 pb, que se pueden anotar en el genoma humano para la identificación de genes.

Comparación con SAGE

La secuencia de etiqueta más larga confiere una mayor especificidad que la etiqueta SAGE clásica de 9-10 pb . El nivel de expresión genética única está representado por el recuento de transcripciones presentes por millón de moléculas, similar a la salida de SAGE. Una ventaja significativa es el tamaño de la biblioteca más grande en comparación con SAGE. Una biblioteca MPSS normalmente contiene 1 millón de etiquetas de firma, que es aproximadamente 20 veces el tamaño de una biblioteca SAGE. Algunas de las desventajas relacionadas con SAGE también se aplican a MPSS, como la pérdida de ciertas transcripciones debido a la falta de un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción y la ambigüedad en la anotación de la etiqueta. La alta sensibilidad y la expresión génica absoluta ciertamente favorecen a MPSS. Sin embargo, la tecnología solo está disponible a través de Lynxgen Therapeutics, Inc. (luego Solexa Inc hasta 2006 y luego Illumina ).

Referencias

Otras lecturas

enlaces externos