Secuenciación de semiconductores de iones - Ion semiconductor sequencing
La secuenciación de semiconductores de iones es un método de secuenciación de ADN basado en la detección de iones de hidrógeno que se liberan durante la polimerización del ADN . Este es un método de "secuenciación por síntesis", durante el cual se construye una hebra complementaria basada en la secuencia de una hebra molde .
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Un micropocillo que contiene una hebra de ADN molde que se va a secuenciar se inunda con una única especie de desoxirribonucleótido trifosfato (dNTP). Si el dNTP introducido es complementario al nucleótido molde principal, se incorpora a la hebra complementaria en crecimiento. Esto provoca la liberación de un ión de hidrógeno que activa un sensor de iones ISFET , lo que indica que se ha producido una reacción. Si hay repeticiones de homopolímeros presentes en la secuencia de la plantilla, se incorporarán múltiples moléculas de dNTP en un solo ciclo. Esto conduce a un número correspondiente de hidrógenos liberados y una señal electrónica proporcionalmente más alta.
Esta tecnología se diferencia de otras tecnologías de secuenciación por síntesis en que no se utilizan nucleótidos ni ópticos modificados . La secuenciación de semiconductores de iones también puede denominarse secuenciación de Ion Torrent, secuenciación mediada por pH, secuenciación de silicio o secuenciación de semiconductores.
Historia del desarrollo tecnológico
La tecnología fue licenciada por DNA Electronics Ltd, desarrollada por Ion Torrent Systems Inc. y fue lanzada en febrero de 2010. Ion Torrent ha comercializado su máquina como un secuenciador rápido, compacto y económico que se puede utilizar en una gran cantidad de laboratorios como banco. máquina superior. 454 Life Sciences de Roche se ha asociado con DNA Electronics en el desarrollo de una plataforma de secuenciación de semiconductores de alta densidad y lectura larga que utiliza esta tecnología.
Tecnología
Química de secuenciación
En la naturaleza, la incorporación de un desoxirribonucleósido trifosfato (dNTP) en una cadena de ADN en crecimiento implica la formación de un enlace covalente y la liberación de pirofosfato y un ion hidrógeno cargado positivamente . Solo se incorporará un dNTP si es complementario del nucleótido de plantilla no apareado principal. La secuenciación de semiconductores de iones aprovecha estos hechos determinando si se libera un ión de hidrógeno al proporcionar una única especie de dNTP a la reacción.
Los micropocillos en un chip semiconductor, cada uno de los cuales contiene muchas copias de una molécula de ADN de plantilla monocatenaria que se va a secuenciar y la ADN polimerasa, se inundan secuencialmente con A, C, G o T dNTP sin modificar . Si un dNTP introducido es complementario al siguiente nucleótido desapareado en la hebra molde, la ADN polimerasa lo incorpora a la hebra complementaria en crecimiento. Si el dNTP introducido no es complementario, no hay incorporación ni reacción bioquímica. El ion de hidrógeno que se libera en la reacción cambia el pH de la solución, que es detectado por un ISFET . Las moléculas de dNTP no unidas se eliminan antes del siguiente ciclo cuando se introduce una especie de dNTP diferente.
Detección de señal
Debajo de la capa de micropocillos hay una capa sensible a los iones, debajo de la cual hay un sensor de iones ISFET . Todas las capas están contenidas dentro de un chip semiconductor CMOS , similar al que se usa en la industria electrónica.
Cada chip contiene una serie de micropocillos con los correspondientes detectores ISFET . Cada ión de hidrógeno liberado activa el sensor de iones ISFET . La serie de pulsos eléctricos transmitidos desde el chip a una computadora se traduce en una secuencia de ADN, sin que se requiera conversión de señal intermedia. Debido a que los eventos de incorporación de nucleótidos se miden directamente mediante electrónica, se evita el uso de nucleótidos marcados y mediciones ópticas. El procesamiento de la señal y el ensamblaje del ADN se pueden llevar a cabo en el software.
Características de secuenciación
La precisión por base lograda internamente por Ion Torrent en el secuenciador de semiconductores Ion Torrent Ion en febrero de 2011 fue del 99,6% en base a 50 lecturas base , con 100 Mb por ejecución. La longitud de lectura a febrero de 2011 era de 100 pares de bases . La precisión para las repeticiones de homopolímeros de 5 repeticiones de longitud fue del 98%. Las versiones posteriores muestran una longitud de lectura de 400 pares de bases. Estas cifras aún no se han verificado de forma independiente fuera de la empresa.
Fortalezas
Los principales beneficios de la secuenciación de semiconductores de iones son la rápida velocidad de secuenciación y los bajos costos iniciales y operativos. Esto ha sido posible evitando nucleótidos modificados y mediciones ópticas.
Debido a que el sistema registra los eventos de incorporación de nucleótidos mediados por la polimerasa natural, la secuenciación puede ocurrir en tiempo real. En realidad, la velocidad de secuenciación está limitada por el ciclo de los nucleótidos del sustrato a través del sistema. Ion Torrent Systems Inc., el desarrollador de la tecnología, afirma que cada medición de incorporación toma 4 segundos y cada ejecución toma aproximadamente una hora, durante la cual se secuencian 100-200 nucleótidos. Si se mejoran los chips semiconductores (como predice la ley de Moore ), el número de lecturas por chip (y por lo tanto por ejecución) debería aumentar.
El costo de adquirir un secuenciador mediado por pH de Ion Torrent Systems Inc. en el momento del lanzamiento tenía un precio de alrededor de $ 50,000 USD, excluyendo el equipo de preparación de muestras y un servidor para análisis de datos. El costo por ejecución también es significativamente menor que el de los métodos alternativos de secuenciación automatizada, aproximadamente $ 1,000.
Limitaciones
Si el homopolímero se repite del mismo nucleótido (p. Ej. TTTTT ) están presentes en la hebra molde (hebra a secuenciar), luego se incorporan múltiples nucleótidos introducidos y se liberan más iones hidrógeno en un solo ciclo. Esto da como resultado un mayor cambio de pH y una señal electrónica proporcionalmente mayor. Ésta es una limitación del sistema, ya que es difícil enumerar repeticiones largas. Esta limitación es compartida por otras técnicas que detectan adiciones de un solo nucleótido como la pirosecuenciación . Las señales generadas a partir de un número elevado de repeticiones son difíciles de diferenciar de las repeticiones de un número similar pero diferente; por ejemplo , las homorrepeticiones de longitud 7 son difíciles de diferenciar de las de longitud 8.
Otra limitación de este sistema es la longitud de lectura corta en comparación con otros métodos de secuenciación como la secuenciación de Sanger o la pirosecuenciación . Las longitudes de lectura más largas son beneficiosas para el ensamblaje del genoma de novo . Los secuenciadores de semiconductores Ion Torrent producen una longitud de lectura promedio de aproximadamente 400 nucleótidos por lectura.
El rendimiento es actualmente más bajo que el de otras tecnologías de secuenciación de alto rendimiento, aunque los desarrolladores esperan cambiar esto aumentando la densidad del chip .
Solicitud
Los desarrolladores de la secuenciación de semiconductores Ion Torrent lo han comercializado como un secuenciador rápido, compacto y económico que se puede utilizar en un gran número de laboratorios como máquina de sobremesa. La compañía espera que su sistema lleve la secuenciación fuera de los centros especializados y al alcance de hospitales y laboratorios más pequeños. Un artículo del New York Times de enero de 2011, "Llevando la secuenciación del ADN a las masas" , subraya estas ambiciones.
Debido a la capacidad de los métodos de secuenciación alternativas para conseguir un mayor leer longitud (y por lo tanto de ser más adecuado para el análisis del genoma completo ) esta tecnología puede ser el más adecuado para aplicaciones a pequeña escala, tales como microbiana secuenciación del genoma, microbiano transcriptoma de secuenciación, la secuencia específica, amplicón secuenciación , o para pruebas de calidad de bibliotecas de secuenciación.