Cromatografía iónica - Ion chromatography

Un moderno sistema de cromatografía iónica

La cromatografía iónica (o cromatografía de intercambio iónico ) separa los iones y las moléculas polares en función de su afinidad por el intercambiador de iones . Funciona en casi cualquier tipo de molécula cargada, incluidas proteínas grandes , nucleótidos pequeños y aminoácidos . Sin embargo, la cromatografía iónica debe realizarse en condiciones que estén a una unidad del punto isoeléctrico de una proteína.

Los dos tipos de cromatografía iónica son el intercambio aniónico y el intercambio catiónico. La cromatografía de intercambio catiónico se utiliza cuando la molécula de interés está cargada positivamente. La molécula está cargada positivamente porque el pH para la cromatografía es menor que el pI (a / k / a pH (I)). En este tipo de cromatografía, la fase estacionaria está cargada negativamente y las moléculas cargadas positivamente se cargan para ser atraídas por ella. La cromatografía de intercambio aniónico es cuando la fase estacionaria está cargada positivamente y las moléculas cargadas negativamente (lo que significa que el pH para la cromatografía es mayor que el pI) se cargan para ser atraídas por ella. A menudo se utiliza en la purificación de proteínas, análisis de agua y control de calidad. Las moléculas cargadas y solubles en agua, tales como proteínas, aminoácidos y péptidos, se unen a restos que están cargados de manera opuesta formando enlaces iónicos con la fase estacionaria insoluble. La fase estacionaria equilibrada consiste en un grupo funcional ionizable donde las moléculas objetivo de una mezcla que se va a separar y cuantificar pueden unirse mientras pasan a través de la columna; se usa una fase estacionaria catiónica para separar los aniones y una fase estacionaria aniónica para separar los cationes. La cromatografía de intercambio catiónico se usa cuando las moléculas que se desean separar son cationes y la cromatografía de intercambio aniónico se usa para separar aniones. A continuación, las moléculas unidas se pueden eluir y recolectar usando un eluyente que contiene aniones y cationes haciendo pasar una mayor concentración de iones a través de la columna o cambiando el pH de la columna.

Una de las principales ventajas del uso de la cromatografía iónica es solo una interacción involucrada durante la separación en contraposición a otras técnicas de separación; por lo tanto, la cromatografía iónica puede tener una mayor tolerancia de matriz. Otra ventaja del intercambio iónico es la previsibilidad de los patrones de elución (basados ​​en la presencia del grupo ionizable). Por ejemplo, cuando se usa la cromatografía de intercambio catiónico, los cationes se eluirán en último lugar. Mientras tanto, las moléculas cargadas negativamente eluirán primero. Sin embargo, también existen desventajas al realizar la cromatografía de intercambio iónico, como la evolución constante de la técnica que conduce a la inconsistencia de una columna a otra. Una limitación importante de esta técnica de purificación es que se limita al grupo ionizable.

Historia

Cromatografía de intercambio de iones

La cromatografía iónica ha avanzado gracias a la acumulación de conocimientos a lo largo de muchos años. A partir de 1947, Spedding y Powell utilizaron la cromatografía de intercambio iónico de desplazamiento para la separación de las tierras raras. Además, mostraron la separación por intercambio iónico de los isótopos 14N y 15N en el amoníaco. A principios de la década de 1950, Kraus y Nelson demostraron el uso de muchos métodos analíticos para iones metálicos que dependen de la separación de sus complejos de cloruro, fluoruro, nitrato o sulfato mediante cromatografía de aniones. La detección automática en línea se introdujo progresivamente desde 1960 hasta 1980, así como nuevos métodos cromatográficos para separaciones de iones metálicos. Un método innovador de Small, Stevens y Bauman en Dow Chemical Co. desarrolló la creación de la cromatografía iónica moderna. Los aniones y cationes ahora podrían separarse de manera eficiente mediante un sistema de detección de conductividad suprimida. En 1979, Gjerde et al. Introdujeron un método para la cromatografía de aniones con detección de conductividad no suprimida. A continuación, en 1980, se utilizó un método similar para la cromatografía catiónica.

Como resultado, comenzó un período de competencia extrema dentro del mercado de circuitos integrados, con partidarios de la detección de conductividad tanto suprimida como no suprimida. Esta competencia condujo a un rápido crecimiento de nuevas formas y a la rápida evolución de IC. Un desafío que debe superarse en el desarrollo futuro de IC es la preparación de columnas monolíticas de intercambio iónico altamente eficientes y superar este desafío sería de gran importancia para el desarrollo de IC.

El auge de la cromatografía de intercambio iónico comenzó principalmente entre 1935 y 1950 durante la Segunda Guerra Mundial y fue a través del " proyecto Manhattan " que las aplicaciones y la IC se ampliaron significativamente. La cromatografía iónica fue introducida originalmente por dos investigadores ingleses, Sir Thompson agrícola y el químico JT Way. Los trabajos de Thompson y Way involucraron la acción de sales fertilizantes solubles en agua, sulfato de amonio y cloruro de potasio. Estas sales no podían extraerse fácilmente del suelo debido a la lluvia. Realizaron métodos de iones para tratar arcillas con las sales, lo que resultó en la extracción de amoníaco además de la liberación de calcio. Fue en los años cincuenta y sesenta cuando se desarrollaron modelos teóricos para IC para su mayor comprensión y no fue hasta los setenta cuando se utilizaron detectores continuos, allanando el camino para el desarrollo de la cromatografía de baja presión a la de alto rendimiento. No fue sino hasta 1975 que se estableció la "cromatografía iónica" como un nombre en referencia a las técnicas, y posteriormente se utilizó como nombre con fines de marketing. Hoy en día, la CI es importante para investigar sistemas acuosos, como el agua potable. Es un método popular para analizar elementos o complejos aniónicos que ayudan a resolver problemas ambientalmente relevantes. Asimismo, también tiene grandes usos en la industria de los semiconductores .

Debido a las abundantes columnas de separación, sistemas de elución y detectores disponibles, la cromatografía se ha convertido en el método principal para el análisis de iones.

Cuando esta técnica se desarrolló inicialmente, se utilizó principalmente para el tratamiento de agua. Desde 1935, la cromatografía de intercambio iónico se manifestó rápidamente en una de las técnicas más aprovechadas, y sus principios a menudo se aplican a la mayoría de los campos de la química, incluida la destilación, la adsorción y la filtración.

Principio

Cromatograma de iones que muestra la separación de aniones

La cromatografía de intercambio iónico separa las moléculas en función de sus respectivos grupos cargados. La cromatografía de intercambio iónico retiene las moléculas de analito en la columna en función de las interacciones culómbicas (iónicas). La matriz de cromatografía de intercambio iónico consta de iones cargados positiva y negativamente. Esencialmente, las moléculas experimentan interacciones electrostáticas con cargas opuestas en la matriz de fase estacionaria. La fase estacionaria consiste en una matriz inmóvil que contiene ligandos o grupos funcionales ionizables cargados. La superficie de la fase estacionaria muestra grupos funcionales iónicos (RX) que interactúan con iones analitos de carga opuesta. Para lograr la electroneutralidad, estas cargas inertes se acoplan con contraiones intercambiables en la solución. Las moléculas ionizables que deben purificarse compiten con estos contraiones intercambiables por unirse a las cargas inmovilizadas en la fase estacionaria. Estas moléculas ionizables se retienen o eluyen en función de su carga. Inicialmente, las moléculas que no se unen o se unen débilmente a la fase estacionaria son las primeras en eliminarse. Se necesitan condiciones alteradas para la elución de las moléculas que se unen a la fase estacionaria. La concentración de los contraiones intercambiables, que compite con las moléculas por unirse, se puede aumentar o se puede cambiar el pH. Un cambio en el pH afecta la carga de las moléculas particulares y, por lo tanto, altera la unión. Luego, las moléculas comienzan a eluirse en función de los cambios en sus cargas debido a los ajustes. Además, estos ajustes pueden usarse para liberar la proteína de interés. Además, la concentración de contraiones se puede variar gradualmente para separar moléculas ionizadas. Este tipo de elución se denomina elución en gradiente. Por otro lado, se puede usar elución por etapas en las que la concentración de contraiones se varía en una etapa. Este tipo de cromatografía se subdivide además en cromatografía de intercambio catiónico y cromatografía de intercambio aniónico . Las moléculas cargadas positivamente se unen a las resinas de intercambio catiónico, mientras que las moléculas cargadas negativamente se unen a las resinas de intercambio aniónico. El compuesto iónico que consiste en la especie catiónica M + y la especie aniónica B- puede ser retenido por la fase estacionaria.

La cromatografía de intercambio catiónico retiene cationes cargados positivamente porque la fase estacionaria muestra un grupo funcional cargado negativamente:

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La cromatografía de intercambio aniónico retiene los aniones utilizando un grupo funcional cargado positivamente:

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Tenga en cuenta que la fuerza iónica de C + o A- en la fase móvil se puede ajustar para cambiar la posición de equilibrio, por lo tanto, el tiempo de retención.

El cromatograma de iones muestra un cromatograma típico obtenido con una columna de intercambio aniónico.

Procedimiento

Antes de que pueda iniciarse la cromatografía de intercambio iónico, debe equilibrarse. La fase estacionaria debe equilibrarse con ciertos requisitos que dependen del experimento con el que esté trabajando. Una vez equilibrados, los iones cargados en la fase estacionaria se unirán a sus iones intercambiables cargados opuestos. Iones intercambiables como Cl- o Na +. A continuación, se debe elegir un tampón al que se pueda unir la proteína deseada. Después del equilibrio, la columna debe lavarse. La fase de lavado ayudará a eluir todas las impurezas que no se unan a la matriz mientras la proteína de interés permanece unida. Este tampón de muestra debe tener el mismo pH que el tampón utilizado para el equilibrio para ayudar a unir las proteínas deseadas. Las proteínas no cargadas se eluirán de la columna a una velocidad similar a la del tampón que fluye a través de la columna. Una vez que la muestra se ha cargado en la columna y la columna se ha lavado con el tampón para eluir todas las proteínas no deseadas, se lleva a cabo la elución para eluir las proteínas deseadas que están unidas a la matriz. Las proteínas unidas se eluyen utilizando un gradiente de concentración de sal que aumenta linealmente. Con el aumento de la fuerza iónica del tampón, los iones de sal competirán con las proteínas deseadas para unirse a los grupos cargados en la superficie del medio. Esto hará que las proteínas deseadas se eluyan de la columna. Las proteínas que tienen una carga neta baja se eluirán primero a medida que aumenta la concentración de sal, lo que hace que aumente la fuerza iónica. Las proteínas con una carga neta alta necesitarán una fuerza iónica más alta para poder eluirlas de la columna. Es posible realizar cromatografía de intercambio iónico a granel, en capas delgadas de medio como placas de vidrio o plástico recubiertas con una capa de la fase estacionaria deseada, o en columnas de cromatografía. La cromatografía en capa fina o la cromatografía en columna comparten similitudes en el sentido de que ambas actúan dentro de los mismos principios rectores; Hay un intercambio constante y frecuente de moléculas a medida que la fase móvil viaja a lo largo de la fase estacionaria. No es imperativo agregar la muestra en volúmenes minúsculos ya que se han elegido las condiciones predeterminadas para la columna de intercambio de modo que haya una fuerte interacción entre las fases móvil y estacionaria. Además, el mecanismo del proceso de elución provocará una compartimentación de las diferentes moléculas en función de sus respectivas características químicas. Este fenómeno se debe a un aumento en las concentraciones de sal en o cerca de la parte superior de la columna, desplazando así las moléculas en esa posición, mientras que las moléculas unidas hacia abajo se liberan en un punto posterior cuando la concentración de sal más alta alcanza esa área. Estos principios son las razones por las que la cromatografía de intercambio iónico es un candidato excelente para los pasos de cromatografía iniciales en un procedimiento de purificación complejo, ya que puede producir rápidamente pequeños volúmenes de moléculas diana independientemente de un mayor volumen inicial.

La cámara (izquierda) contiene una alta concentración de sal. La cámara de agitación (derecha) contiene una baja concentración de sal. La agitación gradual provoca la formación de un gradiente de sal a medida que la sal viaja de concentraciones altas a bajas.

A menudo se utilizan dispositivos comparativamente simples para aplicar contraiones de gradiente creciente a una columna de cromatografía. Los contraiones como el cobre (II) se eligen con mayor frecuencia para separar eficazmente péptidos y aminoácidos mediante la formación de complejos.

Se puede utilizar un dispositivo simple para crear un gradiente de sal. El tampón de elución se extrae constantemente de la cámara a la cámara de mezcla, alterando así su concentración de tampón. Generalmente, el tampón colocado en la cámara suele ser de alta concentración inicial, mientras que el tampón colocado en la cámara agitada suele ser de baja concentración. A medida que el tampón de alta concentración de la cámara izquierda se mezcla y se introduce en la columna, la concentración de tampón de la columna agitada aumenta gradualmente. La alteración de las formas de la cámara agitada, así como del búfer límite, permite la producción de gradientes de contraión cóncavos, lineales o convexos.

Se utilizan multitud de medios diferentes para la fase estacionaria. Entre los grupos cargados inmovilizados más comunes que se utilizan se encuentran trimetilaminoetilo (TAM), trietilaminoetilo (TEAE), dietil-2-hidroxipropilaminoetilo (QAE), aminoetilo (AE), dietilaminoetilo (DEAE), sulfo (S), sulfometilo (SM), sulfopropilo ( SP), carboxi (C) y carboximetilo (CM).

El empaquetamiento exitoso de la columna es un aspecto importante de la cromatografía iónica. La estabilidad y la eficiencia de una columna final dependen de los métodos de empaque, el solvente utilizado y los factores que afectan las propiedades mecánicas de la columna. En contraste con los primeros métodos ineficientes de empaque en seco, el empaque en suspensión húmeda, en el que las partículas que están suspendidas en un solvente apropiado se entregan a una columna bajo presión, muestra una mejora significativa. Se pueden emplear tres enfoques diferentes para realizar el empaquetamiento de suspensión húmeda: el método de densidad equilibrada (la densidad del disolvente es aproximadamente la de las partículas de sílice porosas), el método de alta viscosidad (se utiliza un solvente de alta viscosidad) y el método de suspensión de baja viscosidad (realizado con disolventes de baja viscosidad).

El poliestireno se utiliza como medio para el intercambio iónico. Está hecho de la polimerización de estireno con el uso de divinilbenceno y peróxido de benzoilo. Dichos intercambiadores forman interacciones hidrofóbicas con proteínas que pueden ser irreversibles. Debido a esta propiedad, los intercambiadores de iones de poliestireno no son adecuados para la separación de proteínas. Por otro lado, se utilizan para la separación de pequeñas moléculas en la separación de aminoácidos y la eliminación de sal del agua. Se pueden usar intercambiadores de iones de poliestireno con poros grandes para la separación de proteínas, pero deben recubrirse con una sustancia hidrófila.

El medio a base de celulosa se puede utilizar para la separación de moléculas grandes ya que contienen poros grandes. La unión a proteínas en este medio es alta y tiene un carácter hidrófobo bajo. DEAE es una matriz de intercambio aniónico que se produce a partir de un grupo lateral positivo de dietilaminoetilo unido a celulosa o Sephadex.

El medio a base de gel de agarosa también contiene poros grandes, pero su capacidad de sustitución es menor en comparación con los dextranos. La capacidad del medio para hincharse en líquido se basa en la reticulación de estas sustancias, el pH y las concentraciones de iones de los tampones utilizados.

La incorporación de alta temperatura y presión permite un aumento significativo en la eficiencia de la cromatografía iónica, junto con una disminución en el tiempo. La temperatura influye en la selectividad debido a sus efectos sobre las propiedades de retención. El factor de retención ( k = ( t _R ^g - t _M ^g ) / ( t _M ^g - t _ext )) aumenta con la temperatura para iones pequeños, y se observa la tendencia opuesta para iones más grandes.

A pesar de la selectividad iónica en diferentes medios, se están realizando más investigaciones para realizar cromatografía de intercambio iónico en el rango de 40–175 ° C.

Se puede elegir un disolvente apropiado basándose en las observaciones de cómo se comportan las partículas de la columna en un disolvente. Usando un microscopio óptico, se puede distinguir fácilmente un estado disperso deseable de suspensión de partículas agregadas.

Intercambiadores de iones fuertes y débiles

Un intercambiador de iones "fuerte" no perderá la carga en su matriz una vez que la columna esté equilibrada, por lo que se puede utilizar una amplia gama de tampones de pH. Los intercambiadores de iones "débiles" tienen un rango de valores de pH en los que mantendrán su carga. Si el pH del tampón usado para una columna de intercambio iónico débil se sale del rango de capacidad de la matriz, la columna perderá su distribución de carga y la molécula de interés puede perderse. A pesar del rango de pH más pequeño de los intercambiadores de iones débiles, a menudo se usan sobre los intercambiadores de iones fuertes debido a que tienen una mayor especificidad. En algunos experimentos, los tiempos de retención de los intercambiadores de iones débiles son lo suficientemente largos para obtener los datos deseados con una alta especificidad.

Las resinas (a menudo denominadas "perlas") de las columnas de intercambio iónico pueden incluir grupos funcionales como ácidos débiles / fuertes y bases débiles / fuertes. También hay columnas especiales que tienen resinas con grupos funcionales anfóteros que pueden intercambiar cationes y aniones. Algunos ejemplos de grupos funcionales de resinas de intercambio iónico fuertes son el catión de amonio cuaternario (Q), que es un intercambiador de aniones, y el ácido sulfónico (S, -SO ₂ OH), que es un intercambiador de cationes. Estos tipos de intercambiadores pueden mantener su densidad de carga en un rango de pH de 0-14. Ejemplos de grupos funcionales de resinas de intercambio iónico débiles incluyen dietilaminoetilo (DEAE, -C ₂ H ₄ N (CH ₂ H ₅ ) ₂ ), que es un intercambiador de aniones, y carboximetilo (CM, -CH ₂ -COOH), que es un intercambiador de cationes. Estos dos tipos de intercambiadores pueden mantener la densidad de carga de sus columnas en un rango de pH de 5-9.

En la cromatografía iónica, la interacción de los iones soluto y la fase estacionaria basada en sus cargas determina qué iones se unirán y en qué grado. Cuando la fase estacionaria presenta grupos positivos que atraen aniones, se llama intercambiador de aniones; cuando hay grupos negativos en la fase estacionaria, los cationes son atraídos y es un intercambiador de cationes. La atracción entre los iones y la fase estacionaria también depende de la resina, partículas orgánicas que se utilizan como intercambiadores de iones.

Cada resina presenta una selectividad relativa que varía según los iones de soluto presentes que competirán para unirse al grupo de resina en la fase estacionaria. El coeficiente de selectividad, el equivalente a la constante de equilibrio, se determina mediante una relación de las concentraciones entre la resina y cada ión, sin embargo, la tendencia general es que los intercambiadores de iones prefieren unirse al ión con una carga más alta, un radio hidratado más pequeño y mayor polarizabilidad, o la capacidad de que la nube de electrones de un ion sea interrumpida por otras cargas. A pesar de esta selectividad, cantidades excesivas de un ión con una selectividad menor introducidas en la columna harían que el ión menor se una más a la fase estacionaria, ya que el coeficiente de selectividad permite fluctuaciones en la reacción de unión que tiene lugar durante la cromatografía de intercambio iónico.

La siguiente tabla muestra los intercambiadores de iones de uso común

Técnica típica

Se introduce una muestra, ya sea manualmente o con un muestreador automático , en un bucle de muestra de volumen conocido. Una solución acuosa tamponada conocida como fase móvil transporta la muestra del circuito a una columna que contiene algún tipo de material de fase estacionaria. Esta es típicamente una matriz de resina o gel que consta de agarosa o perlas de celulosa con grupos funcionales cargados unidos covalentemente . Es necesario equilibrar la fase estacionaria para obtener la carga deseada de la columna. Si la columna no está correctamente equilibrada, es posible que la molécula deseada no se una con fuerza a la columna. Los analitos diana (aniones o cationes) se retienen en la fase estacionaria pero pueden eluirse aumentando la concentración de una especie cargada de manera similar que desplaza los iones del analito de la fase estacionaria. Por ejemplo, en la cromatografía de intercambio catiónico, el analito cargado positivamente se puede desplazar agregando iones de sodio cargados positivamente. A continuación, los analitos de interés deben detectarse por algún medio, normalmente por conductividad o absorbancia de luz UV / visible.

El control de un sistema de CI generalmente requiere un sistema de datos cromatográficos (CDS). Además de los sistemas de CI, algunos de estos CDS también pueden controlar la cromatografía de gases (GC) y la HPLC.

Cromatografía de intercambio de membranas

Un tipo de cromatografía de intercambio iónico, el intercambio de membrana es un método de purificación relativamente nuevo diseñado para superar las limitaciones del uso de columnas llenas de perlas. Los dispositivos cromatográficos de membrana son baratos de producir en masa y desechables a diferencia de otros dispositivos cromatográficos que requieren mantenimiento y tiempo para revalidarlos. Hay tres tipos de absorbentes de membrana que se utilizan normalmente para separar sustancias. Los tres tipos son hoja plana, fibra hueca y flujo radial. El absorbente más común y más adecuado para la cromatografía de membrana son las láminas planas múltiples porque tiene más volumen absorbente. Puede usarse para superar las limitaciones de transferencia de masa y la caída de presión, lo que lo hace especialmente ventajoso para aislar y purificar virus, ADN plasmídico y otras macromoléculas grandes. La columna está llena de membranas microporosas con poros internos que contienen restos adsorbentes que pueden unirse a la proteína diana. Las membranas adsorbentes están disponibles en una variedad de geometrías y química, lo que permite su uso para purificación y también para fraccionamiento, concentración y clarificación con una eficiencia 10 veces mayor que la del uso de perlas. Las membranas se pueden preparar mediante el aislamiento de la propia membrana, donde las membranas se cortan en cuadrados y se inmovilizan. Un método más reciente implicó el uso de células vivas que están unidas a una membrana de soporte y se utilizan para la identificación y clarificación de moléculas de señalización.

Separación de proteínas

Columna de intercambio iónico a escala preparativa utilizada para la purificación de proteínas .

La cromatografía de intercambio iónico se puede utilizar para separar proteínas porque contienen grupos funcionales cargados. Los iones de interés (en este caso proteínas cargadas) se intercambian por otros iones (generalmente H ⁺ ) en un soporte sólido cargado. Los solutos se encuentran más comúnmente en una fase líquida, que tiende a ser agua. Tomemos, por ejemplo, las proteínas en el agua, que sería una fase líquida que pasa por una columna. La columna se conoce comúnmente como fase sólida, ya que está llena de partículas sintéticas porosas que tienen una carga particular. Estas partículas porosas también se denominan perlas, pueden estar aminadas (que contienen grupos amino) o tener iones metálicos para tener una carga. La columna se puede preparar utilizando polímeros porosos, para macromoléculas de más de 100.000, el tamaño óptimo de la partícula porosa es de aproximadamente 1 µm ² . Esto se debe a que la difusión lenta de los solutos dentro de los poros no restringe la calidad de la separación. Las perlas que contienen grupos cargados positivamente, que atraen las proteínas cargadas negativamente, se denominan comúnmente resinas de intercambio aniónico. Los aminoácidos que tienen cadenas laterales cargadas negativamente a pH 7 (pH del agua) son el glutamato y el aspartato. Las perlas que están cargadas negativamente se denominan resinas de intercambio catiónico, ya que se atraerán proteínas cargadas positivamente. Los aminoácidos que tienen cadenas laterales cargadas positivamente a pH 7 son lisina, histidina y arginina.

El punto isoeléctrico es el pH al que un compuesto, en este caso una proteína, no tiene carga neta. El punto isoeléctrico o PI de una proteína se puede determinar utilizando el pKa de las cadenas laterales, si el amino (cadena positiva) es capaz de cancelar la cadena carboxilo (negativa), la proteína estaría en su PI. Usar tampones en lugar de agua para las proteínas que no tienen carga a pH 7 es una buena idea, ya que permite la manipulación del pH para alterar las interacciones iónicas entre las proteínas y las perlas. Las cadenas laterales débilmente ácidas o básicas pueden tener una carga si el pH es lo suficientemente alto o bajo, respectivamente. La separación se puede lograr basándose en el punto isoeléctrico natural de la proteína. Alternativamente, se puede agregar genéticamente una etiqueta peptídica a la proteína para darle a la proteína un punto isoeléctrico alejado de la mayoría de las proteínas naturales (por ejemplo, 6 argininas para unirse a una resina de intercambio catiónico o 6 glutamatos para unirse a una resina de intercambio aniónico como DEAE -Sepharose).

La elución mediante el aumento de la fuerza iónica de la fase móvil es más sutil. Funciona porque los iones de la fase móvil interactúan con los iones inmovilizados en la fase estacionaria, "protegiendo" la fase estacionaria de la proteína y dejando que la proteína eluya.

La elución de las columnas de intercambio iónico puede ser sensible a los cambios de una sola carga: cromatoenfoque . La cromatografía de intercambio iónico también es útil en el aislamiento de conjuntos de proteínas multiméricas específicas, lo que permite la purificación de complejos específicos según el número y la posición de las etiquetas peptídicas cargadas.

Efecto Gibbs-Donnan

En la cromatografía de intercambio iónico, el efecto Gibbs-Donnan se observa cuando el pH del tampón aplicado y el intercambiador de iones difieren, incluso hasta una unidad de pH. Por ejemplo, en las columnas de intercambio de aniones, los intercambiadores de iones rechazan los protones, por lo que el pH del tampón cerca de la columna es más alto que el del resto del solvente. Como resultado, un experimentador debe tener cuidado de que la proteína o proteínas de interés sean estables y estén cargadas correctamente en el pH "real".

Este efecto se produce como resultado de dos partículas cargadas de manera similar, una de la resina y otra de la solución, que no se distribuyen correctamente entre los dos lados; hay una captación selectiva de un ion sobre otro. Por ejemplo, en una resina de poliestireno sulfonado, una resina de intercambio catiónico, el ión cloro de un tampón de ácido clorhídrico debe equilibrarse en la resina. Sin embargo, dado que la concentración del ácido sulfónico en la resina es alta, el hidrógeno del HCl no tiene tendencia a entrar en la columna. Esto, combinado con la necesidad de electroneutralidad, conduce a una cantidad mínima de hidrógeno y cloro que ingresa a la resina.

Usos

Utilidad clínica

El uso de la cromatografía iónica se puede ver en la cromatografía de argentación . Por lo general, la plata y los compuestos que contienen enlaces acetilénicos y etilénicos tienen interacciones muy débiles. Este fenómeno ha sido ampliamente probado en compuestos olefínicos. Los complejos de iones que las olefinas hacen con los iones de plata son débiles y se basan en la superposición de los orbitales pi, sigma yd y, por lo tanto, los electrones disponibles no causan cambios reales en el doble enlace. Este comportamiento se manipuló para separar lípidos, principalmente ácidos grasos de mezclas en fracciones con diferente número de dobles enlaces utilizando iones de plata. Las resinas de iones se impregnaron con iones de plata, que luego se expusieron a varios ácidos (ácido silícico) para eluir ácidos grasos de diferentes características.

Se pueden obtener límites de detección tan bajos como 1 µM para iones de metales alcalinos. Puede usarse para medir HbA1c , porfirina y con purificación de agua . Las Resinas de Intercambio Iónico (IER) han sido ampliamente utilizadas especialmente en medicamentos debido a su alta capacidad y al sencillo sistema del proceso de separación. Uno de los usos sintéticos es el uso de resinas de intercambio iónico para diálisis renal. Este método se utiliza para separar los elementos sanguíneos mediante el uso de un riñón artificial con membranas de celulosa.

Otra aplicación clínica de la cromatografía iónica es la técnica de cromatografía de intercambio aniónico rápida utilizada para separar las isoenzimas de la creatincinasa (CK) del suero humano y el tejido procedente de material de autopsia (se utilizaron principalmente tejidos ricos en CK, como el músculo cardíaco y el cerebro). Estas isoenzimas incluyen MM, MB y BB, todas las cuales realizan la misma función dadas diferentes secuencias de aminoácidos. Las funciones de estas isoenzimas son convertir la creatina, utilizando ATP, en fosfocreatina que expulsa ADP. Se llenaron minicolumnas con DEAE-Sephadex A-50 y se eluyeron adicionalmente con cloruro de sodio tris-tampón a diversas concentraciones (cada concentración se eligió ventajosamente para manipular la elución). El extracto de tejido humano se insertó en columnas para su separación. Todas las fracciones se analizaron para ver la actividad de CK total y se encontró que cada fuente de isoenzimas de CK tenía isoenzimas características en su interior. En primer lugar, se eluyó CK-MM, luego CK-MB, seguido de CK-BB. Por lo tanto, las isoenzimas encontradas en cada muestra podrían usarse para identificar la fuente, ya que eran específicas de tejido.

Utilizando la información de los resultados, se pudo establecer una correlación entre el diagnóstico de los pacientes y el tipo de isoenzimas CK que se encuentran en la actividad más abundante. A partir del hallazgo, aproximadamente 35 de los 71 pacientes estudiados sufrieron un ataque cardíaco (infarto de miocardio) también contenían una cantidad abundante de isoenzimas CK-MM y CK-MB. Los hallazgos muestran además que muchos otros diagnósticos, como insuficiencia renal, enfermedad cerebrovascular y enfermedad pulmonar, solo tenían la isoenzima CK-MM y ninguna otra isoenzima. Los resultados de este estudio indican correlaciones entre varias enfermedades y las isoenzimas CK encontradas, lo que confirma los resultados de pruebas anteriores utilizando varias técnicas. Los estudios sobre CK-MB que se encuentran en víctimas de ataques cardíacos se han ampliado desde este estudio y aplicación de la cromatografía iónica.

Aplicaciones industriales

Desde 1975, la cromatografía iónica se ha utilizado ampliamente en muchas ramas de la industria. Las principales ventajas beneficiosas son confiabilidad, muy buena exactitud y precisión, alta selectividad, alta velocidad, alta eficiencia de separación y bajo costo de los consumibles. El desarrollo más significativo relacionado con la cromatografía iónica son los nuevos métodos de preparación de muestras; mejorar la velocidad y selectividad de la separación de analitos; reducción de límites de detección y límites de cuantificación; ampliar el alcance de las aplicaciones; desarrollo de nuevos métodos estándar; miniaturización y ampliación del alcance del análisis de un nuevo grupo de sustancias. Permite realizar pruebas cuantitativas de electrolitos y aditivos patentados de baños de galvanoplastia . Es un avance de las pruebas cualitativas de células de casco o pruebas UV menos precisas. Se pueden medir iones, catalizadores, abrillantadores y aceleradores. La cromatografía de intercambio iónico se ha convertido gradualmente en una técnica universal ampliamente conocida para la detección de especies tanto aniónicas como catiónicas. Se han desarrollado, o están en desarrollo, aplicaciones para tales fines para una variedad de campos de interés y, en particular, la industria farmacéutica. El uso de la cromatografía de intercambio iónico en productos farmacéuticos ha aumentado en los últimos años, y en 2006, se agregó oficialmente un capítulo sobre cromatografía de intercambio iónico al Formulario Nacional de Farmacopea de los Estados Unidos (USP-NF). Además, en el lanzamiento de la USP-NF en 2009, la Farmacopea de los Estados Unidos puso a disposición varios análisis de cromatografía iónica utilizando dos técnicas: detección de conductividad y detección amperométrica de pulso . La mayoría de estas aplicaciones se utilizan principalmente para medir y analizar límites residuales en productos farmacéuticos, incluida la detección de límites de oxalato, yoduro, sulfato, sulfamato, fosfato, así como varios electrolitos, incluidos potasio y sodio. En total, la edición de 2009 de la USP-NF lanzó oficialmente veintiocho métodos de detección para el análisis de compuestos activos, o componentes de compuestos activos, utilizando detección de conductividad o detección amperométrica de pulso.

Desarrollo de fármacos

Un sistema de cromatografía iónica utilizado para detectar y medir cationes como sodio, amonio y potasio en formulaciones expectorantes para la tos.

Ha habido un interés creciente en la aplicación de la CI en el análisis de fármacos. IC se utiliza en diferentes aspectos del desarrollo de productos y pruebas de control de calidad. Por ejemplo, la CI se utiliza para mejorar la estabilidad y las propiedades de solubilidad de las moléculas de fármacos activos farmacéuticos, así como para detectar sistemas que tienen una mayor tolerancia a los disolventes orgánicos. IC se ha utilizado para la determinación de analitos como parte de una prueba de disolución. Por ejemplo, las pruebas de disolución de calcio han demostrado que otros iones presentes en el medio pueden resolverse bien entre sí y también a partir del ión calcio. Por tanto, la CI se ha empleado en fármacos en forma de comprimidos y cápsulas para determinar la cantidad de fármaco que se disuelve con el tiempo. La CI también se usa ampliamente para la detección y cuantificación de excipientes o ingredientes inactivos usados ​​en formulaciones farmacéuticas. La detección de azúcar y alcohol de azúcar en tales formulaciones a través de IC se ha realizado debido a que estos grupos polares se resuelven en la columna de iones. La metodología IC también se estableció en el análisis de impurezas en sustancias y productos farmacéuticos. Se evalúan las impurezas o cualquier componente que no forme parte de la entidad química del fármaco y brindan información sobre las cantidades máximas y mínimas de fármaco que deben administrarse a un paciente por día.

Ver también

• Cromatografía de intercambio aniónico
• Cromatoenfoque
• Cromatografía líquida de alta resolución
• Punto isoeléctrico

Referencias

Bibliografía

• Pequeño, Hamish (1989). Cromatografía iónica . Nueva York: Plenum Press. ISBN 978-0-306-43290-3.
• Tatjana Weiss; Weiss, Joachim (2005). Manual de cromatografía iónica . Weinheim: Wiley-VCH. ISBN 978-3-527-28701-7.
• Gjerde, Douglas T .; Fritz, James S. (2000). Cromatografía iónica . Weinheim: Wiley-VCH. ISBN 978-3-527-29914-0.
• Jackson, Peter; Haddad, Paul R. (1990). Cromatografía iónica: principios y aplicaciones . Amsterdam: Elsevier. ISBN 978-0-444-88232-5.
• Mercer, Donald W. (1974). "Separación de isoenzimas de creatina quinasa tisular y sérica por cromatografía en columna de intercambio iónico" . Química clínica . 20 (1): 36–40. doi : 10.1093 / clinchem / 20.1.36 . PMID  4809470 .
• Morris, LJ (1966). "Separaciones de lípidos por cromatografía de iones de plata" . Revista de investigación de lípidos . 7 (6): 717–732. doi : 10.1016 / S0022-2275 (20) 38948-3 . PMID  5339485 .
• Ghosh, Raja (2002). "Separación de proteínas mediante cromatografía de membrana: oportunidades y desafíos". Journal of Chromatography A . 952 (1): 13-27. doi : 10.1016 / s0021-9673 (02) 00057-2 . PMID  12064524 .

enlaces externos

• Medios relacionados con la cromatografía iónica en Wikimedia Commons

• LC Instruments en Curlie