Secuenciación de tintes Illumina - Illumina dye sequencing
La secuenciación de tintes de Illumina es una técnica que se utiliza para determinar la serie de pares de bases en el ADN , también conocida como secuenciación de ADN . El concepto de química terminada reversible fue inventado por Bruno Canard y Simon Sarfati en el Instituto Pasteur de París. Fue desarrollado por Shankar Balasubramanian y David Klenerman de la Universidad de Cambridge, quienes posteriormente fundaron Solexa, una compañía que luego adquirió Illumina . Este método de secuenciación se basa en terminadores de colorante reversibles que permiten la identificación de nucleótidos individuales a medida que se lavan sobre cadenas de ADN. También se puede utilizar para secuenciación de región y genoma completo, análisis de transcriptoma , metagenómica , descubrimiento de ARN pequeño , perfil de metilación y análisis de interacción proteína - ácido nucleico en todo el genoma .
Visión general
La tecnología de secuenciación de Illumina funciona en tres pasos básicos: amplificar, secuenciar y analizar. El proceso comienza con ADN purificado. El ADN se fragmenta y se agregan adaptadores que contienen segmentos que actúan como puntos de referencia durante la amplificación, secuenciación y análisis. El ADN modificado se carga en una celda de flujo donde se llevará a cabo la amplificación y secuenciación. La celda de flujo contiene nanopozos que espacian los fragmentos y ayudan con el hacinamiento. Cada nanopozo contiene oligonucleótidos que proporcionan un punto de anclaje para que los adaptadores se unan. Una vez que los fragmentos se han adherido, comienza una fase llamada generación de clústeres. Este paso produce alrededor de mil copias de cada fragmento de ADN y se realiza mediante PCR de amplificación en puente. A continuación, los cebadores y los nucleótidos modificados se lavan en el chip. Estos nucleótidos tienen un bloqueador fluorescente 3 'reversible, por lo que la ADN polimerasa solo puede agregar un nucleótido a la vez en el fragmento de ADN. Después de cada ronda de síntesis, una cámara toma una fotografía del chip. Una computadora determina qué base se agregó por la longitud de onda de la etiqueta fluorescente y la registra para cada punto en el chip. Después de cada ronda, las moléculas no incorporadas se eliminan por lavado. A continuación, se utiliza un paso de desbloqueo químico para eliminar el grupo bloqueador del terminal fluorescente 3 '. El proceso continúa hasta que se secuencia la molécula de ADN completa. Con esta tecnología, miles de lugares en todo el genoma se secuencian a la vez mediante secuenciación paralela masiva .
Procedimiento
Biblioteca genómica
Después de purificar el ADN, es necesario generar una biblioteca de ADN, una biblioteca genómica. Hay dos formas de crear una biblioteca genómica: sonificación y etiquetado. Con el etiquetado, las transposasas cortan aleatoriamente el ADN en tamaños de fragmentos de 50 a 500 pb y agregan adaptadores simultáneamente. También se puede generar una biblioteca genética usando sonificación para fragmentar el ADN genómico. La sonificación fragmenta el ADN en tamaños similares utilizando ondas de sonido ultrasónicas. Los adaptadores derecho e izquierdo deberán estar unidos por la ADN polimerasa T7 y la ADN ligasa T4 después de la sonificación. Las hebras que no tienen adaptadores ligados se eliminan por lavado.
Adaptadores
Los adaptadores contienen tres segmentos diferentes: la secuencia complementaria al soporte sólido (oligonucleótidos en la celda de flujo), la secuencia de código de barras (índices) y el sitio de unión para el cebador de secuenciación. Los índices suelen tener una longitud de seis pares de bases y se utilizan durante el análisis de la secuencia de ADN para identificar muestras. Los índices permiten ejecutar juntas hasta 96 muestras diferentes, esto también se conoce como multiplexación. Durante el análisis, la computadora agrupará todas las lecturas con el mismo índice. Illumina utiliza un enfoque de "secuencia por síntesis". Este proceso tiene lugar dentro de una celda de flujo de vidrio recubierta de acrilamida. La celda de flujo tiene oligonucleótidos (secuencias de nucleótidos cortas) que recubren la parte inferior de la celda y sirven como soporte sólido para mantener las hebras de ADN en su lugar durante la secuenciación. A medida que el ADN fragmentado se lava sobre la celda de flujo, el adaptador apropiado se une al soporte sólido complementario.
Amplificación de puente
Una vez conectado, puede comenzar la generación de clústeres. El objetivo es crear cientos de hebras idénticas de ADN. Algunos serán el hilo delantero; el resto, al revés. Por eso se utilizan adaptadores derecho e izquierdo. Los clústeres se generan a través de la amplificación del puente. La ADN polimerasa se mueve a lo largo de una hebra de ADN, creando su hebra complementaria. La hebra original se lava, dejando solo la hebra inversa. En la parte superior de la hebra inversa hay una secuencia de adaptadores. La hebra de ADN se dobla y se une al oligo que es complementario a la secuencia del adaptador superior. Las polimerasas se unen a la hebra inversa y se forma su hebra complementaria (que es idéntica a la original). El ahora ADN de doble hebra se desnaturaliza para que cada hebra pueda unirse por separado a una secuencia de oligonucleótidos anclada a la celda de flujo. Uno será el hilo inverso; el otro, el delantero. Este proceso se llama amplificación puente y ocurre en miles de grupos en toda la celda de flujo a la vez.
Amplificación clonal
Una y otra vez, las hebras de ADN se doblarán y se unirán al soporte sólido. La ADN polimerasa sintetizará una nueva hebra para crear un segmento de doble hebra, que se desnaturalizará para que todas las hebras de ADN en un área sean de una sola fuente (amplificación clonal). La amplificación clonal es importante para fines de control de calidad. Si se encuentra que una hebra tiene una secuencia extraña, los científicos pueden verificar la hebra inversa para asegurarse de que tenga el complemento de la misma rareza. Las hebras de avance y retroceso actúan como controles para protegerse contra artefactos. Debido a que la secuenciación de Illumina utiliza ADN polimerasa, se han observado errores de sustitución de bases, especialmente en el extremo 3 '. Las lecturas finales emparejadas combinadas con la generación de clústeres pueden confirmar que se produjo un error. Las hebras inversa y directa deben ser complementarias entre sí, todas las lecturas inversas deben coincidir entre sí y todas las lecturas directas deben coincidir entre sí. Si una lectura no es lo suficientemente similar a sus contrapartes (con las que debería ser un clon), es posible que se haya producido un error. En los análisis de algunos laboratorios se ha utilizado un umbral mínimo del 97% de similitud.
Secuencia por síntesis
Al final de la amplificación clonal, todas las hebras inversas se eliminan por lavado de la celda de flujo, dejando solo hebras delanteras. Un cebador se adhiere al sitio de unión del cebador del adaptador de hebras directas, y una polimerasa agrega un dNTP marcado con fluorescencia a la hebra de ADN. Solo se puede agregar una base por ronda debido a que el fluoróforo actúa como un grupo de bloqueo; sin embargo, el grupo de bloqueo es reversible. Usando la química de cuatro colores, cada una de las cuatro bases tiene una emisión única, y después de cada ronda, la máquina registra qué base se agregó. Una vez que se registra el color, se lava el fluoróforo y se lava otro dNTP sobre la celda de flujo y se repite el proceso.
A partir del lanzamiento de NextSeq y más tarde de MiniSeq, Illumina introdujo una nueva química de secuenciación de dos colores. Los nucleótidos se distinguen por uno de dos colores (rojo o verde), sin color ("negro") o combinando ambos colores (apareciendo naranja como una mezcla entre rojo y verde).
Una vez que se ha leído la hebra de ADN, la hebra que se acaba de agregar se lava. Luego, la imprimación de índice 1 se adhiere, polimeriza la secuencia de índice 1 y se lava. La hebra vuelve a formar un puente y el extremo 3 'de la hebra de ADN se une a un oligo en la celda de flujo. El cebador de índice 2 se adhiere, polimeriza la secuencia y se lava.
Una polimerasa secuencia la hebra complementaria en la parte superior de la hebra arqueada. Se separan y se bloquea el extremo de 3 'de cada hebra. La hebra delantera se elimina por lavado y el proceso de secuencia por síntesis se repite para la hebra inversa.
Análisis de los datos
La secuenciación ocurre para millones de grupos a la vez, y cada grupo tiene aproximadamente 1000 copias idénticas de un inserto de ADN. Los datos de la secuencia se analizan encontrando fragmentos con áreas superpuestas, llamados contigs , y alineándolos. Si se conoce una secuencia de referencia, los contigs se comparan con ella para identificar la variante.
Este proceso fragmentado permite a los científicos ver la secuencia completa aunque nunca se ejecutó una secuencia no fragmentada; sin embargo, debido a que las longitudes de lectura de Illumina no son muy largas (la secuenciación de HiSeq puede producir longitudes de lectura de alrededor de 90 pb), puede ser difícil resolver áreas de repetición en tándem cortas. Además, si la secuencia es de novo y no existe una referencia, las áreas repetidas pueden causar mucha dificultad en el ensamblaje de la secuencia. Las dificultades adicionales incluyen sustituciones de bases (especialmente en el extremo 3 'de las lecturas) por polimerasas inexactas, secuencias quiméricas y sesgo de PCR, todo lo cual puede contribuir a generar una secuencia incorrecta.
Comparación con otros métodos de secuenciación
Esta técnica ofrece varias ventajas sobre los métodos de secuenciación tradicionales como la secuenciación de Sanger . La secuenciación de Sanger requiere dos reacciones, una para el cebador directo y otra para el cebador inverso. A diferencia de Illumina, la secuenciación de Sanger utiliza trifosfatos de didesoxinucleósidos marcados con fluorescencia (ddNTP) para determinar la secuencia del fragmento de ADN. A los ddNTP les falta el grupo 3 'OH y terminan la síntesis de ADN de forma permanente. En cada tubo de reacción, se agregan dNTP y ddNTP, junto con la ADN polimerasa y los cebadores. La proporción de ddNTP a dNTP es importante, ya que el ADN de la plantilla debe sintetizarse por completo, y una sobreabundancia de ddNTP creará múltiples fragmentos del mismo tamaño y posición de la plantilla de ADN. Cuando la ADN polimerasa agrega un ddNTP, el fragmento termina y se sintetiza un nuevo fragmento. Cada fragmento sintetizado es un nucleótido más largo que el anterior. Una vez que la plantilla de ADN se ha sintetizado por completo, los fragmentos se separan mediante electroforesis capilar. En la parte inferior del tubo capilar, un láser excita los ddNTP marcados con fluorescencia y una cámara captura el color emitido.
Debido a la naturaleza automatizada de la secuenciación de tintes de Illumina, es posible secuenciar múltiples hebras a la vez y obtener datos de secuenciación reales rápidamente. Con la secuenciación de Sanger, solo se puede secuenciar una hebra a la vez y es relativamente lenta. Illumina solo usa ADN polimerasa en lugar de múltiples y costosas enzimas requeridas por otras técnicas de secuenciación (es decir, pirosecuenciación ).
Ejemplos de uso
La secuenciación de Illumina se ha utilizado para investigar transcriptomas de la batata y el género Taxus de gimnospermas .