Proyección de alto impacto - High-throughput screening

Robots de cribado de alto rendimiento

El cribado de alto rendimiento ( HTS ) es un método de experimentación científica que se utiliza especialmente en el descubrimiento de fármacos y es relevante para los campos de la biología y la química . Mediante el uso de robótica , software de control / procesamiento de datos, dispositivos de manipulación de líquidos y detectores sensibles, la detección de alto rendimiento permite al investigador realizar rápidamente millones de pruebas químicas, genéticas o farmacológicas. A través de este proceso, se pueden identificar rápidamente compuestos activos, anticuerpos o genes que modulan una vía biomolecular particular. Los resultados de estos experimentos proporcionan puntos de partida para el diseño de fármacos y para comprender la falta de interacción o el papel de un lugar en particular.

Preparación de la placa de ensayo

Un brazo de robot maneja una placa de ensayo.

El material de laboratorio o recipiente de prueba clave de HTS es la placa de microtitulación : un recipiente pequeño, generalmente desechable y hecho de plástico, que presenta una rejilla de pequeños divots abiertos llamados pozos . En general, las microplacas para HTS tienen 96, 192, 384, 1536, 3456 o 6144 pocillos. Todos estos son múltiplos de 96, lo que refleja la microplaca original de 96 pocillos con pozos espaciados de 8 x 12 con un espaciado de 9 mm. La mayoría de los pozos contienen elementos de prueba, según la naturaleza del experimento. Estos podrían ser diferentes compuestos químicos disueltos, por ejemplo, en una solución acuosa de dimetilsulfóxido (DMSO). Los pozos también podrían contener células o enzimas de algún tipo. (Los otros pocillos pueden estar vacíos o contener disolvente puro o muestras sin tratar, destinadas a utilizarse como controles experimentales ).

Una instalación de detección suele tener una biblioteca de placas de stock , cuyo contenido se cataloga cuidadosamente, y cada uno de los cuales puede haber sido creado por el laboratorio u obtenido de una fuente comercial. Estas placas madre en sí mismas no se utilizan directamente en experimentos; en su lugar, se crean placas de ensayo separadas según sea necesario. Una placa de ensayo es simplemente una copia de una placa madre, creada pipeteando una pequeña cantidad de líquido (a menudo medido en nanolitros ) de los pocillos de una placa madre a los pocillos correspondientes de una placa completamente vacía.

Observación de reacciones

Para prepararse para un ensayo , el investigador llena cada pocillo de la placa con alguna entidad biológica sobre la que desea realizar el experimento, como una proteína , células o un embrión animal . Después de que haya pasado un tiempo de incubación para permitir que la materia biológica se absorba, se una o reaccione (o no reaccione) con los compuestos en los pocillos, se toman medidas en todos los pocillos de la placa, ya sea manualmente o con una máquina. Las mediciones manuales suelen ser necesarias cuando el investigador utiliza microscopía para (por ejemplo) buscar cambios o defectos en el desarrollo embrionario causados ​​por los compuestos de los pozos, buscando efectos que una computadora no podría determinar fácilmente por sí misma. De lo contrario, una máquina de análisis automatizada especializada puede ejecutar una serie de experimentos en los pozos (como iluminarlos con luz polarizada y medir la reflectividad, que puede ser una indicación de la unión de proteínas). En este caso, la máquina genera el resultado de cada experimento como una cuadrícula de valores numéricos, y cada número se asigna al valor obtenido de un solo pozo. Una máquina de análisis de alta capacidad puede medir docenas de placas en el espacio de unos minutos como este, generando miles de puntos de datos experimentales muy rápidamente.

Dependiendo de los resultados de este primer ensayo, el investigador puede realizar ensayos de seguimiento dentro de la misma pantalla seleccionando líquido de los pozos de origen que dieron resultados interesantes (conocidos como "hits") en nuevas placas de ensayo, y luego volviendo a ejecutar el experimento para recopilar más datos sobre este conjunto reducido, confirmando y refinando las observaciones.

Sistemas de automatización

Un sistema de carrusel para almacenar placas de ensayo para una alta capacidad de almacenamiento y acceso de alta velocidad

La automatización es un elemento importante en la utilidad de HTS. Normalmente, un sistema de robot integrado que consta de uno o más robots transporta microplacas de ensayo de una estación a otra para la adición de muestras y reactivos, mezcla, incubación y, finalmente, lectura o detección. Por lo general, un sistema HTS puede preparar, incubar y analizar muchas placas simultáneamente, lo que acelera aún más el proceso de recopilación de datos. Actualmente existen robots HTS que pueden probar hasta 100.000 compuestos por día. Los recolectores de colonias automáticos seleccionan miles de colonias microbianas para un cribado genético de alto rendimiento. El término uHTS o cribado de rendimiento ultra alto se refiere (alrededor de 2008) al cribado de más de 100.000 compuestos por día.

Diseño experimental y análisis de datos

Con la capacidad de detección rápida de diversos compuestos (como moléculas pequeñas o ARNip ) para identificar compuestos activos, HTS ha llevado a una explosión en la tasa de datos generados en los últimos años. En consecuencia, uno de los desafíos más fundamentales en los experimentos de HTS es obtener significado bioquímico de montones de datos, que se basa en el desarrollo y adopción de diseños experimentales y métodos analíticos apropiados para el control de calidad y la selección de aciertos. La investigación de HTS es uno de los campos que tiene una característica descrita por John Blume, director científico de Applied Proteomics, Inc., de la siguiente manera: Pronto, si un científico no comprende algunas estadísticas o tecnologías rudimentarias de manejo de datos, es posible que no será considerado un verdadero biólogo molecular y, por lo tanto, simplemente se convertirá en "un dinosaurio".

Control de calidad

Los ensayos de HTS de alta calidad son fundamentales en los experimentos de HTS. El desarrollo de ensayos HTS de alta calidad requiere la integración de enfoques tanto experimentales como computacionales para el control de calidad (QC). Tres medios importantes de CC son (i) un buen diseño de placa, (ii) la selección de controles químicos / biológicos positivos y negativos efectivos, y (iii) el desarrollo de métricas de CC eficaces para medir el grado de diferenciación de modo que los ensayos con datos inferiores se puede identificar la calidad. Un buen diseño de placa ayuda a identificar errores sistemáticos (especialmente aquellos relacionados con la posición del pozo) y determinar qué normalización debe usarse para eliminar / reducir el impacto de los errores sistemáticos tanto en el control de calidad como en la selección de aciertos.

Los métodos de control de calidad analíticos efectivos sirven como un guardián para ensayos de excelente calidad. En un experimento típico de HTS, una clara distinción entre un control positivo y una referencia negativa, como un control negativo, es un índice de buena calidad. Se han propuesto muchas medidas de evaluación de la calidad para medir el grado de diferenciación entre un control positivo y una referencia negativa. Para evaluar la calidad de los datos se han adoptado la relación señal / fondo, la relación señal / ruido, la ventana de señal, la relación de variabilidad del ensayo y el factor Z. Recientemente se ha propuesto una diferencia de medias estrictamente estandarizada ( SSMD ) para evaluar la calidad de los datos en los ensayos de HTS.

Selección de aciertos

Un compuesto con un tamaño deseado de efectos en un HTS se llama acierto. El proceso de selección de aciertos se denomina selección de aciertos. Los métodos analíticos para la selección de aciertos en pantallas sin réplicas (generalmente en pantallas primarias) difieren de los que tienen réplicas (normalmente en pantallas confirmatorias). Por ejemplo, el método de puntuación z es adecuado para pantallas sin réplicas, mientras que la estadística t es adecuada para pantallas con réplicas. El cálculo de SSMD para pantallas sin réplicas también difiere del de las pantallas con réplicas.

Para la selección de aciertos en las pantallas primarias sin réplicas, los fácilmente interpretables son el cambio de pliegue promedio, la diferencia de promedio, el porcentaje de inhibición y el porcentaje de actividad. Sin embargo, no capturan la variabilidad de los datos de forma eficaz. El método de puntuación z o SSMD, que puede capturar la variabilidad de los datos basándose en la suposición de que cada compuesto tiene la misma variabilidad que una referencia negativa en las pantallas. Sin embargo, los valores atípicos son comunes en los experimentos de HTS y los métodos como el puntaje z son sensibles a los valores atípicos y pueden ser problemáticos. Como consecuencia, se han propuesto y adoptado métodos robustos como el método z * -score, SSMD *, el método B-score y el método basado en cuantiles para la selección de aciertos.

En una pantalla con réplicas, podemos estimar directamente la variabilidad de cada compuesto; como consecuencia, deberíamos usar SSMD o estadístico t que no se base en el supuesto sólido en el que se basan la puntuación z y la puntuación z *. Un problema con el uso de la estadística t y los valores p asociados es que se ven afectados tanto por el tamaño de la muestra como por el tamaño del efecto. Provienen de pruebas sin diferencia de medias y, por lo tanto, no están diseñadas para medir el tamaño de los efectos compuestos. Para la selección de aciertos, el mayor interés es el tamaño del efecto en un compuesto probado. SSMD evalúa directamente el tamaño de los efectos. También se ha demostrado que SSMD es mejor que otros tamaños de efecto de uso común. El valor poblacional de SSMD es comparable en todos los experimentos y, por lo tanto, podemos usar el mismo límite para el valor poblacional de SSMD para medir el tamaño de los efectos compuestos.

Técnicas para aumentar el rendimiento y la eficiencia

Se pueden emplear distribuciones únicas de compuestos en una o muchas placas para aumentar el número de ensayos por placa o para reducir la variación de los resultados del ensayo, o ambos. La suposición simplificadora hecha en este enfoque es que cualquier compuesto de N en el mismo pozo no interactuará típicamente entre sí, o con el objetivo del ensayo, de una manera que cambie fundamentalmente la capacidad del ensayo para detectar aciertos verdaderos.

Por ejemplo, imagine una placa en la que el compuesto A está en los pocillos 1-2-3, el compuesto B está en los pocillos 2-3-4 y el compuesto C está en los pocillos 3-4-5. En un ensayo de esta placa contra un objetivo dado, un impacto en los pocillos 2, 3 y 4 indicaría que el compuesto B es el agente más probable, mientras que también proporciona tres medidas de la eficacia del compuesto B contra el objetivo especificado. Las aplicaciones comerciales de este enfoque implican combinaciones en las que dos compuestos nunca comparten más de un pozo, para reducir la posibilidad (de segundo orden) de interferencia entre pares de compuestos que se analizan.

Avances recientes

Los científicos del NIH Chemical Genomics Center (NCGC) aprovecharon la automatización y los formatos de ensayo de bajo volumen para desarrollar HTS cuantitativo (qHTS), un paradigma para perfilar farmacológicamente grandes bibliotecas químicas mediante la generación de relaciones completas de concentración-respuesta para cada compuesto. Con el ajuste de curvas adjunto y el software de quimioinformática, los datos qHTS producen la mitad de la concentración efectiva máxima (EC50), la respuesta máxima, el coeficiente de Hill (nH) para toda la biblioteca, lo que permite la evaluación de las relaciones de actividad de estructura naciente (SAR).

En marzo de 2010, se publicó una investigación que demuestra un proceso HTS que permite un cribado 1000 veces más rápido (100 millones de reacciones en 10 horas) a una millonésima parte del costo (utilizando 10 −7 veces el volumen de reactivo) que las técnicas convencionales que utilizan microfluidos basados ​​en gotas. Las gotas de fluido separadas por aceite reemplazan los pozos de las microplacas y permiten el análisis y la clasificación de golpes mientras los reactivos fluyen a través de los canales.

En 2010, los investigadores desarrollaron una lámina de silicona de lentes que se puede colocar sobre matrices de microfluidos para permitir la medición de fluorescencia de 64 canales de salida diferentes simultáneamente con una sola cámara. Este proceso puede analizar 200.000 gotas por segundo.

En 2013, los investigadores revelaron un enfoque con pequeñas moléculas de plantas. En general, es esencial proporcionar validaciones de prueba de concepto de alta calidad en las primeras etapas del proceso de descubrimiento de fármacos. Aquí las tecnologías que permiten la identificación de sondas químicas potentes, selectivas y biodisponibles son de crucial interés, incluso si los compuestos resultantes requieren una mayor optimización para su desarrollo en un producto farmacéutico. El receptor nuclear RORα, una proteína a la que se ha dirigido durante más de una década para identificar agonistas potentes y biodisponibles, se utilizó como ejemplo de un fármaco diana muy desafiante. Los golpes se confirman en el paso de cribado debido a la curva en forma de campana. Este método es muy similar al método HTS cuantitativo (detección y confirmación de aciertos al mismo tiempo), excepto que el uso de este enfoque disminuye en gran medida el número de puntos de datos y puede detectar fácilmente más de 100.000 compuestos biológicos relevantes.

En el que el descubrimiento de fármacos HTS tradicionales utiliza proteínas purificadas o células intactas, un desarrollo reciente muy interesante de la tecnología se asocia con el uso de organismos vivos intactos, como el nematodo Caenorhabditis elegans y el pez cebra ( Danio rerio ).

En 2016-2018, los fabricantes de placas comenzaron a producir productos químicos especializados para permitir la producción en masa de superficies repelentes de células de adherencia ultrabaja, lo que facilitó el rápido desarrollo de ensayos susceptibles de HTS para abordar el descubrimiento de fármacos contra el cáncer en tejidos 3D como organoides y esferoides; un formato más fisiológicamente relevante.

Aumento de la utilización de HTS en el mundo académico para la investigación biomédica

HTS es una innovación relativamente reciente, factible en gran parte gracias a los avances modernos en robótica y tecnología informática de alta velocidad. Todavía se necesita un laboratorio de detección altamente especializado y costoso para ejecutar una operación de HTS, por lo que en muchos casos una institución de investigación de tamaño pequeño a moderado utilizará los servicios de una instalación de HTS existente en lugar de establecer una para sí misma.

Existe una tendencia en el mundo académico a que las universidades sean su propia empresa de descubrimiento de fármacos. Estas instalaciones, que normalmente solo se encuentran en la industria, ahora también se encuentran cada vez más en las universidades. UCLA , por ejemplo, cuenta con un laboratorio de HTS de acceso abierto, recursos compartidos de detección molecular (MSSR, UCLA), que puede analizar más de 100.000 compuestos al día de forma rutinaria. La política de acceso abierto garantiza que los investigadores de todo el mundo puedan aprovechar esta facilidad sin largas negociaciones de propiedad intelectual. Con una biblioteca de compuestos de más de 200.000 moléculas pequeñas, el MSSR tiene una de las plataformas de compuestos más grandes de todas las universidades de la costa oeste. Además, el MSSR presenta capacidades genómicas funcionales completas (ARNip, ARNhc, ADNc y CRISPR en todo el genoma) que son complementarias a los esfuerzos de moléculas pequeñas: La genómica funcional aprovecha las capacidades de HTS para ejecutar pantallas de ancho del genoma que examinan la función de cada gen en el contexto de interés. ya sea eliminando cada gen o sobreexpresándolo. El acceso paralelo a la detección de moléculas pequeñas de alto rendimiento y una pantalla amplia del genoma permite a los investigadores realizar la identificación y validación de objetivos para una enfermedad determinada o la determinación del modo de acción en una molécula pequeña. Los resultados más precisos pueden obtenerse mediante el uso de bibliotecas de genómica funcional "ordenadas", es decir, cada biblioteca contiene una única construcción, tal como un solo ARNip o ADNc. La genómica funcional se empareja típicamente con el cribado de alto contenido utilizando, por ejemplo, microscopía epifluorescente o citometría de barrido láser.

La Universidad de Illinois también tiene instalaciones para HTS, al igual que la Universidad de Minnesota. El Instituto de Ciencias de la Vida de la Universidad de Michigan alberga las instalaciones de HTS en el Centro de Genómica Química. La Universidad de Columbia tiene una instalación de recursos compartidos de HTS con ~ 300,000 moléculas pequeñas diversas y ~ 10,000 compuestos bioactivos conocidos disponibles para detección bioquímica, basada en células y basada en NGS. La Universidad de Rockefeller tiene un Centro de recursos de HTS de acceso abierto HTSRC (Universidad de Rockefeller, HTSRC ), que ofrece una biblioteca de más de 380.000 compuestos. El laboratorio de análisis de alto rendimiento de la Northwestern University respalda la identificación de objetivos, la validación, el desarrollo de ensayos y la selección de compuestos. La organización sin fines de lucro Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute también tiene una instalación de HTS de larga data en el Conrad Prebys Center for Chemical Genomics que formaba parte de MLPCN. La organización sin fines de lucro Scripps Research Molecular Screening Center (SRMSC) continúa sirviendo a la academia en todos los institutos posteriores a la era MLPCN. La instalación SRMSC uHTS mantiene una de las colecciones bibliotecarias más grandes del mundo académico, actualmente en más de 665.000 entidades de moléculas pequeñas, y examina de forma rutinaria la colección completa o las subbibliotecas en apoyo de iniciativas de subvenciones de múltiples PI.

En los Estados Unidos, los Institutos Nacionales de Salud o NIH han creado un consorcio nacional de centros de detección de moléculas pequeñas para producir herramientas químicas innovadoras para su uso en la investigación biológica. La Red de Centros de Producción de Sondas de Bibliotecas Moleculares, o MLPCN, realiza HTS en ensayos proporcionados por la comunidad de investigadores, frente a una gran biblioteca de moléculas pequeñas mantenidas en un depósito central de moléculas.

Ver también

Referencias

Otras lecturas

enlaces externos