Fijación (histología) - Fixation (histology)
En los campos de la histología , la patología y la biología celular , la fijación es la preservación de los tejidos biológicos de la descomposición debida a la autólisis o la putrefacción . Termina cualquier reacción bioquímica en curso y también puede aumentar la resistencia mecánica o la estabilidad de los tejidos tratados. La fijación de tejido es un paso crítico en la preparación de cortes histológicos, su amplio objetivo es preservar las células y los componentes del tejido y hacerlo de tal manera que permita la preparación de cortes finos teñidos. Esto permite la investigación de la estructura de los tejidos, que está determinada por las formas y tamaños de macromoléculas (dentro y alrededor de las células) como proteínas y ácidos nucleicos .
Propósitos
Al desempeñar su función protectora, los fijadores desnaturalizan las proteínas por coagulación, formando compuestos aditivos o mediante una combinación de procesos de coagulación y aditivos. Un compuesto que se agrega químicamente a las macromoléculas estabiliza la estructura de manera más efectiva si puede combinarse con partes de dos macromoléculas diferentes, un efecto conocido como reticulación. La fijación de tejido se realiza por varias razones. Una razón es matar el tejido para evitar la descomposición post mórtem (autólisis y putrefacción). La fijación conserva el material biológico ( tejido o células ) lo más cerca posible de su estado natural en el proceso de preparación del tejido para su examen. Para lograr esto, generalmente se deben cumplir varias condiciones.
Primero, un fijador generalmente actúa para inhabilitar las biomoléculas intrínsecas, en particular las enzimas proteolíticas , que de otro modo digieren o dañan la muestra.
En segundo lugar, un fijador típicamente protege una muestra del daño extrínseco. Los fijadores son tóxicos para la mayoría de los microorganismos comunes ( bacterias en particular) que podrían existir en una muestra de tejido o que de otro modo podrían colonizar el tejido fijado. Además, muchos fijadores alteran químicamente el material fijado para hacerlo menos apetecible (indigerible o tóxico) para los microorganismos oportunistas.
Finalmente, los fijadores a menudo alteran las células o tejidos a nivel molecular para aumentar su resistencia mecánica o estabilidad. Esta mayor resistencia y rigidez puede ayudar a preservar la morfología (forma y estructura) de la muestra a medida que se procesa para su posterior análisis.
Incluso la fijación más cuidadosa altera la muestra e introduce artefactos que pueden interferir con la interpretación de la ultraestructura celular. Un ejemplo destacado es el mesosoma bacteriano , que se pensó que era un orgánulo en bacterias grampositivas en la década de 1970, pero más tarde se demostró mediante nuevas técnicas desarrolladas para la microscopía electrónica que era simplemente un artefacto de fijación química. La estandarización de la fijación y otros procedimientos de procesamiento de tejidos tiene en cuenta esta introducción de artefactos, al establecer qué procedimientos introducen qué tipos de artefactos. Los investigadores que saben qué tipos de artefactos esperar con cada tipo de tejido y técnica de procesamiento pueden interpretar con precisión las secciones con artefactos o elegir técnicas que minimicen los artefactos en áreas de interés.
Proceso
La fijación suele ser la primera etapa en un proceso de varios pasos para preparar una muestra de material biológico para microscopía u otro análisis. Por lo tanto, la elección del fijador y el protocolo de fijación puede depender de los pasos de procesamiento adicionales y los análisis finales que se planean. Por ejemplo, la inmunohistoquímica utiliza anticuerpos que se unen a una proteína diana específica. La fijación prolongada puede enmascarar químicamente estos objetivos y prevenir la unión de anticuerpos. En estos casos, se suele utilizar un método de "solución rápida" que utiliza formalina fría durante unas 24 horas. También se puede utilizar metanol (100%) para una fijación rápida, y ese tiempo puede variar según el material biológico. Por ejemplo, las células de cáncer de mama humano MDA-MB 231 se pueden fijar durante solo 3 minutos con metanol frío (-20 ° C). Para los estudios de localización enzimática, los tejidos deben fijarse previamente sólo ligeramente o fijarse posteriormente después de que se haya formado el producto de actividad enzimática.
Tipos
En general, existen tres tipos de procesos de fijación según la muestra inicial:
Fijación por calor: después de que un frotis se haya secado a temperatura ambiente, el portaobjetos se sujeta con pinzas o una pinza para la ropa y se pasa a través de la llama de un mechero Bunsen varias veces para matar por calor y adherir el organismo al portaobjetos. Se utiliza habitualmente con bacterias y arqueas. La fijación por calor generalmente conserva la morfología general pero no las estructuras internas. El calor desnaturaliza la enzima proteolítica y previene la autólisis. La fijación por calor no se puede usar en el método de tinción capsular ya que la fijación por calor encogerá o destruirá la cápsula ( glucocáliz ) y no se puede ver en las manchas.
Inmersión: La muestra de tejido se sumerge en una solución fijadora de volumen como mínimo 20 veces mayor que el volumen del tejido a fijar. El fijador debe difundirse a través del tejido para fijar, por lo que se debe considerar el tamaño y la densidad del tejido, así como el tipo de fijador. Esta es una técnica común para aplicaciones celulares. El uso de una muestra más grande significa que el fijador tarda más en llegar al tejido más profundo.
Perfusión: Fijación a través del flujo sanguíneo. El fijador se inyecta en el corazón con el volumen de inyección que coincide con el gasto cardíaco. El fijador se esparce por todo el cuerpo y el tejido no muere hasta que se fija. Esto tiene la ventaja de preservar una morfología perfecta, pero las desventajas son que el sujeto muere y el costo del volumen de fijador necesario para organismos más grandes es alto.
Fijación química
Tanto en los procesos de fijación por inmersión como por perfusión, los fijadores químicos se utilizan para preservar las estructuras en un estado (tanto química como estructural) lo más cercano posible al tejido vivo. Esto requiere un fijador químico.
Fijadores reticulantes - aldehídos
Los fijadores reticulantes actúan creando enlaces químicos covalentes entre proteínas en los tejidos. Esto ancla las proteínas solubles al citoesqueleto y aporta rigidez adicional al tejido. La preservación de la estructura citoesquelética fina o transitoria, como las contracciones durante las ondas de diferenciación embrionaria, se logra mejor mediante un pretratamiento con microondas antes de la adición de un fijador de reticulación.
El fijador más utilizado en histología es el formaldehído . Por lo general, se usa como formalina tamponada neutra (NBF) al 10%, es decir, aprox. 3,7% –4,0% de formaldehído en tampón de fosfato, pH 7. Dado que el formaldehído es un gas a temperatura ambiente, se usa formaldehído - gas de formaldehído disuelto en agua (~ 37% p / v) - para preparar el primer fijador. El formaldehído fija el tejido reticulando las proteínas, principalmente los residuos del aminoácido básico lisina . Sus efectos son reversibles por exceso de agua y evita la pigmentación con formalina. El paraformaldehído también se usa comúnmente y se despolimerizará de nuevo a formalina cuando se calienta, lo que también lo convierte en un fijador eficaz. Otros beneficios del paraformaldehído incluyen el almacenamiento a largo plazo y una buena penetración en los tejidos. Es particularmente bueno para técnicas de inmunohistoquímica. El vapor de formaldehído también se puede utilizar como fijador para frotis de células.
Otro aldehído popular para la fijación es el glutaraldehído . Funciona de forma similar al formaldehído, provocando la deformación de las hélices α de las proteínas. Sin embargo, el glutaraldehído es una molécula más grande que el formaldehído, por lo que penetra en las membranas más lentamente. En consecuencia, la fijación de glutaraldehído en muestras de tejido más gruesas puede resultar difícil; esto puede solucionarse reduciendo el tamaño de la muestra de tejido. Una de las ventajas de la fijación de glutaraldehído es que puede ofrecer un producto fijo más rígido o fuertemente ligado; su mayor longitud y dos grupos aldehído le permiten "tender un puente" y unir pares de moléculas de proteína más distantes. Provoca cambios rápidos e irreversibles, es muy adecuado para la microscopía electrónica, funciona bien a 4 ° C y proporciona el mejor detalle citoplasmático y nuclear general. Sin embargo, no es ideal para la tinción inmunohistoquímica.
Algunos protocolos de fijación requieren una combinación de formaldehído y glutaraldehído para que sus respectivas fortalezas se complementen entre sí.
Estos fijadores reticulantes, especialmente el formaldehído, tienden a preservar la estructura secundaria de las proteínas y también pueden preservar la mayor parte de la estructura terciaria .
Fijadores precipitantes - alcoholes
Los fijadores precipitantes (o desnaturalizantes ) actúan reduciendo la solubilidad de las moléculas de proteínas y, a menudo, interrumpiendo las interacciones hidrófobas que dan a muchas proteínas su estructura terciaria. La precipitación y agregación de proteínas es un proceso muy diferente al entrecruzamiento que ocurre con los fijadores de aldehídos.
Los fijadores de precipitación más comunes son el etanol y el metanol . Se utilizan comúnmente para reparar cortes y frotis congelados. También se utiliza acetona y se ha demostrado que produce una mejor conservación histológica que las secciones congeladas cuando se emplea en la técnica de acetona metilbenzoato xileno (AMEX).
El metanol, el etanol y la acetona que desnaturalizan las proteínas rara vez se usan solos para fijar bloques, a menos que se estudien los ácidos nucleicos.
El ácido acético es un desnaturalizante que a veces se usa en combinación con otros fijadores precipitantes, como el AFA de Davidson. Se sabe que los alcoholes, por sí mismos, provocan una considerable contracción y endurecimiento del tejido durante la fijación, mientras que el ácido acético solo está asociado con la hinchazón del tejido; la combinación de los dos puede resultar en una mejor conservación de la morfología del tejido .
Agentes oxidantes
Los fijadores oxidantes pueden reaccionar con las cadenas laterales de proteínas y otras biomoléculas, permitiendo la formación de enlaces cruzados que estabilizan la estructura del tejido. Sin embargo, provocan una desnaturalización extensa a pesar de preservar la estructura celular fina y se utilizan principalmente como fijadores secundarios.
El tetróxido de osmio se usa a menudo como un fijador secundario cuando se preparan muestras para microscopía electrónica . (No se utiliza para microscopía óptica ya que penetra muy mal en secciones gruesas de tejido).
El dicromato de potasio , el ácido crómico y el permanganato de potasio encuentran uso en ciertas preparaciones histológicas específicas.
Mercuriales
Los mercuriales como el B-5 y el fijador de Zenker tienen un mecanismo desconocido que aumenta el brillo de la tinción y proporciona un excelente detalle nuclear. A pesar de ser rápidos, los mercuriales penetran mal y producen encogimiento del tejido. Su mejor aplicación es para la fijación de tejidos hematopoyéticos y reticuloendoteliales. También tenga en cuenta que, dado que contienen mercurio, se debe tener cuidado con su eliminación.
Picrates
Los picratos penetran bien en el tejido para reaccionar con histonas y proteínas básicas para formar picratos cristalinos con aminoácidos y precipitar todas las proteínas. Es un buen fijador para el tejido conectivo, conserva bien el glucógeno y extrae los lípidos para dar resultados superiores al formaldehído en la inmunotinción de hormonas biogénicas y polipeptídicas. Sin embargo, provoca una pérdida de basófilos a menos que la muestra se lave minuciosamente después de la fijación.
Fijador HOPE
El efecto de protección con disolventes orgánicos mediado por tampón de ácido hepes-glutámico (HOPE) proporciona una morfología similar a la de la formalina, una excelente conservación de los antígenos proteicos para la inmunohistoquímica y la histoquímica enzimática, buenos rendimientos de ARN y ADN y ausencia de proteínas de reticulación.
Referencias
enlaces externos
|
Recursos de la biblioteca sobre fijación (histología) |