Desnaturalización (bioquímica) - Denaturation (biochemistry)
Proceso de alteración parcial o total de las estructuras nativas secundarias y / o terciarias y / o cuaternarias de proteínas o ácidos nucleicos que dan como resultado una pérdida de bioactividad .
Nota 1 : Modificado de la definición dada en la ref.
Nota 2 : La desnaturalización puede ocurrir cuando las proteínas y los ácidos nucleicos se someten a temperaturas elevadas o a pH extremos, oa concentraciones no fisiológicas de sal, disolventes orgánicos, urea u otros agentes químicos.
Nota 3 : Una enzima pierde su actividad catalítica cuando se desnaturaliza.
La desnaturalización es un proceso en el que las proteínas o ácidos nucleicos pierden la estructura cuaternaria , la estructura terciaria y la estructura secundaria que está presente en su estado nativo , mediante la aplicación de algún estrés externo o compuesto como un ácido o base fuerte , una sal inorgánica concentrada , un solvente orgánico (por ejemplo, alcohol o cloroformo ), agitación y radiación o calor . Si las proteínas en una célula viva se desnaturalizan, esto da como resultado la interrupción de la actividad celular y posiblemente la muerte celular. La desnaturalización de proteínas también es una consecuencia de la muerte celular. Las proteínas desnaturalizadas pueden exhibir una amplia gama de características, desde el cambio conformacional y la pérdida de solubilidad hasta la agregación debido a la exposición de grupos hidrófobos . Las proteínas desnaturalizadas pierden su estructura tridimensional y, por lo tanto, no pueden funcionar.
El plegamiento de proteínas es clave para determinar si una proteína globular o de membrana puede hacer su trabajo correctamente; debe doblarse en la forma correcta para que funcione. Sin embargo, los enlaces de hidrógeno , que desempeñan un papel importante en el plegamiento, son bastante débiles y, por lo tanto, se ven afectados fácilmente por el calor, la acidez, las concentraciones variables de sal y otros factores estresantes que pueden desnaturalizar la proteína. Esta es una de las razones por las que la homeostasis es fisiológicamente necesaria en muchas formas de vida .
Este concepto no está relacionado con el alcohol desnaturalizado , que es el alcohol que se ha mezclado con aditivos para hacerlo inadecuado para el consumo humano.
Ejemplos comunes
Cuando se cocina la comida, algunas de sus proteínas se desnaturalizan. Es por eso que los huevos duros se endurecen y la carne cocida se vuelve firme.
Un ejemplo clásico de desnaturalización en proteínas proviene de las claras de huevo, que generalmente son en gran parte albúminas de huevo en agua. Recién sacadas de los huevos, las claras de huevo son transparentes y líquidas. Cocinar las claras térmicamente inestables las vuelve opacas, formando una masa sólida interconectada. La misma transformación se puede realizar con un químico desnaturalizante. Verter claras de huevo en un vaso de acetona también hará que las claras se vuelvan translúcidas y sólidas. La piel que se forma en la leche cuajada es otro ejemplo común de proteína desnaturalizada. El aperitivo frío conocido como ceviche se prepara "cocinando" químicamente pescado y mariscos crudos en un adobo cítrico ácido, sin calor.
Desnaturalización de proteínas
Las proteínas desnaturalizadas pueden exhibir una amplia gama de características, desde la pérdida de solubilidad hasta la agregación de proteínas .
Fondo
Las proteínas o polipéptidos son polímeros de aminoácidos . Los ribosomas crean una proteína que "lee" el ARN codificado por codones en el gen y ensambla la combinación de aminoácidos necesaria a partir de la instrucción genética , en un proceso conocido como traducción . La cadena de proteína recién creada luego se somete a una modificación postraduccional , en la que se agregan átomos o moléculas adicionales, por ejemplo , cobre , zinc o hierro . Una vez que se ha completado este proceso de modificación postraduccional, la proteína comienza a plegarse (a veces de forma espontánea y a veces con asistencia enzimática ), curvándose sobre sí misma de modo que los elementos hidrófobos de la proteína se entierran profundamente en la estructura y los elementos hidrófilos terminan en la superficie. fuera de. La forma final de una proteína determina cómo interactúa con su entorno.
El plegamiento de proteínas consiste en un equilibrio entre una cantidad sustancial de interacciones intramoleculares débiles dentro de una proteína (interacciones hidrófobas, electrostáticas y de Van Der Waals) y las interacciones proteína-disolvente. Como resultado, este proceso depende en gran medida del estado ambiental en el que reside la proteína. Estas condiciones ambientales incluyen, entre otras, la temperatura , la salinidad , la presión y los disolventes que están involucrados. En consecuencia, cualquier exposición a tensiones extremas (por ejemplo, calor o radiación, altas concentraciones de sales inorgánicas, ácidos y bases fuertes) puede interrumpir la interacción de una proteína e inevitablemente conducir a la desnaturalización.
Cuando se desnaturaliza una proteína, se alteran las estructuras secundaria y terciaria, pero los enlaces peptídicos de la estructura primaria entre los aminoácidos se dejan intactos. Dado que todos los niveles estructurales de la proteína determinan su función, la proteína ya no puede realizar su función una vez que se ha desnaturalizado. Esto contrasta con las proteínas intrínsecamente no estructuradas , que se despliegan en su estado nativo , pero siguen siendo funcionalmente activas y tienden a plegarse al unirse a su objetivo biológico.
Cómo ocurre la desnaturalización a niveles de estructura proteica
- En la desnaturalización de la estructura cuaternaria , las subunidades de proteínas se disocian y / o la disposición espacial de las subunidades de proteínas se interrumpe.
- La desnaturalización de la estructura terciaria implica la interrupción de: covalentes entre cadenas laterales de aminoácidos (como puentes disulfuro entre grupos de cisteína )
- Interacciones dipolo - dipolo no covalentes entre cadenas laterales de aminoácidos polares (y el disolvente circundante )
- Interacciones de Van der Waals (dipolo inducido) entre cadenas laterales de aminoácidos no polares.
Pérdida de función
La mayoría de los sustratos biológicos pierden su función biológica cuando se desnaturalizan. Por ejemplo, las enzimas pierden su actividad , porque los sustratos ya no pueden unirse al sitio activo y porque los residuos de aminoácidos involucrados en los estados de transición de los sustratos estabilizadores ya no están posicionados para poder hacerlo. El proceso de desnaturalización y la pérdida de actividad asociada se pueden medir utilizando técnicas tales como interferometría de polarización dual , CD , QCM-D y MP-SPR .
Pérdida de actividad por metales pesados y metaloides
Al dirigirse a las proteínas, se sabe que los metales pesados alteran la función y la actividad llevada a cabo por las proteínas. Es importante tener en cuenta que los metales pesados se clasifican en categorías que consisten en metales de transición, así como una cantidad selecta de metaloide. Estos metales, cuando interactúan con proteínas plegadas nativas, tienden a jugar un papel en la obstrucción de su actividad biológica. Esta interferencia se puede llevar a cabo de diferentes formas. Estos metales pesados pueden formar un complejo con los grupos funcionales de la cadena lateral presentes en una proteína o formar enlaces a tioles libres. Los metales pesados también juegan un papel en la oxidación de las cadenas laterales de aminoácidos presentes en las proteínas. Junto con esto, al interactuar con las metaloproteínas, los metales pesados pueden dislocar y reemplazar los iones metálicos clave. Como resultado, los metales pesados pueden interferir con las proteínas plegadas, lo que puede disuadir fuertemente la estabilidad y la actividad de las proteínas.
Reversibilidad e irreversibilidad
En muchos casos, la desnaturalización es reversible (las proteínas pueden recuperar su estado original cuando se elimina la influencia desnaturalizante). Este proceso se puede llamar renaturalización. Esta comprensión ha llevado a la idea de que toda la información necesaria para que las proteínas asumieran su estado nativo estaba codificada en la estructura primaria de la proteína y, por tanto, en el ADN que codifica la proteína, la llamada " hipótesis termodinámica de Anfinsen ".
La desnaturalización también puede ser irreversible. Esta irreversibilidad es típicamente una irreversibilidad cinética, no termodinámica, ya que una proteína plegada generalmente tiene menor energía libre que cuando está desplegada. A través de la irreversibilidad cinética, el hecho de que la proteína esté atascada en un mínimo local puede evitar que se repliegue después de haber sido desnaturalizada irreversiblemente.
Desnaturalización de proteínas por pH
La desnaturalización también puede ser causada por cambios en el pH que pueden afectar la química de los aminoácidos y sus residuos. Los grupos ionizables en los aminoácidos pueden ionizarse cuando ocurren cambios en el pH. Un cambio de pH a condiciones más ácidas o más básicas puede inducir el desdoblamiento. El desdoblamiento inducido por ácido a menudo ocurre entre pH 2 y 5, el desdoblamiento inducido por bases generalmente requiere un pH de 10 o más.
Desnaturalización de ácidos nucleicos
Los ácidos nucleicos (incluidos el ARN y el ADN ) son polímeros de nucleótidos sintetizados por las enzimas polimerasas durante la transcripción o la replicación del ADN . Después de la síntesis 5'-3 'del esqueleto, las bases nitrogenadas individuales son capaces de interactuar entre sí mediante enlaces de hidrógeno , lo que permite la formación de estructuras de orden superior. La desnaturalización de los ácidos nucleicos se produce cuando se interrumpe el enlace de hidrógeno entre los nucleótidos y da como resultado la separación de las hebras previamente hibridadas . Por ejemplo, la desnaturalización del ADN debido a las altas temperaturas da como resultado la ruptura de los pares de bases de Watson y Crick y la separación de la hélice de doble hebra en dos hebras simples. Las hebras de ácido nucleico son capaces de reasociarse cuando se restablecen las condiciones " normales ", pero si la restauración se produce demasiado rápido, las hebras de ácido nucleico pueden volver a recocerse de manera imperfecta, lo que da como resultado un apareamiento inadecuado de bases.
Desnaturalización inducida biológicamente
Las interacciones no covalentes entre hebras antiparalelas en el ADN pueden romperse para "abrir" la doble hélice cuando se establezcan que se produzcan mecanismos biológicamente importantes como la replicación del ADN, la transcripción, la reparación del ADN o la unión a proteínas. El área de ADN parcialmente separado se conoce como la burbuja de desnaturalización, que se puede definir más específicamente como la apertura de una doble hélice de ADN a través de la separación coordinada de pares de bases.
El primer modelo que intentó describir la termodinámica de la burbuja de desnaturalización se introdujo en 1966 y se denominó Modelo Polonia-Scheraga. Este modelo describe la desnaturalización de las cadenas de ADN en función de la temperatura . A medida que aumenta la temperatura, los enlaces de hidrógeno entre los pares de bases de Watson y Crick se alteran cada vez más y comienzan a formarse "bucles desnaturalizados". Sin embargo, el modelo Polonia-Scheraga ahora se considera elemental porque no tiene en cuenta las implicaciones de confusión de la secuencia del ADN , la composición química, la rigidez y la torsión .
Estudios termodinámicos recientes han inferido que la vida útil de una burbuja de desnaturalización singular varía de 1 microsegundo a 1 milisegundo. Esta información se basa en escalas de tiempo establecidas de replicación y transcripción del ADN. Actualmente, se están realizando estudios de investigación biofísica y bioquímica para dilucidar más completamente los detalles termodinámicos de la burbuja de desnaturalización.
Desnaturalización por agentes químicos
Dado que la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se encuentra entre los contextos más populares en los que se desea la desnaturalización del ADN, el calentamiento es el método de desnaturalización más frecuente. Además de la desnaturalización por calor, los ácidos nucleicos pueden sufrir el proceso de desnaturalización a través de varios agentes químicos como formamida , guanidina , salicilato de sodio , dimetilsulfóxido (DMSO), propilenglicol y urea . Estos agentes desnaturalizantes químicos reducen la temperatura de fusión (T m ) al competir por los donantes y aceptores de enlaces de hidrógeno con pares de bases nitrogenados preexistentes . Algunos agentes incluso pueden inducir la desnaturalización a temperatura ambiente. Por ejemplo, se ha demostrado que los agentes alcalinos (por ejemplo, NaOH) desnaturalizan el ADN cambiando el pH y eliminando los protones que contribuyen al enlace de hidrógeno. Estos desnaturalizantes se han empleado para fabricar gel de electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE), que promueve la desnaturalización de los ácidos nucleicos con el fin de eliminar la influencia de la forma del ácido nucleico en su movilidad electroforética .
La desnaturalización química como alternativa
La actividad óptica (absorción y dispersión de la luz) y las propiedades hidrodinámicas ( difusión de traslación , coeficientes de sedimentación y tiempos de correlación rotacional ) de los ácidos nucleicos desnaturalizados con formamida son similares a las de los ácidos nucleicos desnaturalizados por calor. Por lo tanto, dependiendo del efecto deseado, desnaturalizar químicamente el ADN puede proporcionar un procedimiento más suave para desnaturalizar ácidos nucleicos que la desnaturalización inducida por calor. Los estudios que comparan diferentes métodos de desnaturalización como calentamiento, molienda de perlas de diferentes tamaños de perlas, sonificación con sonda y desnaturalización química muestran que la desnaturalización química puede proporcionar una desnaturalización más rápida en comparación con los otros métodos de desnaturalización física descritos. Particularmente en los casos en los que se desea una renaturalización rápida, los agentes de desnaturalización química pueden proporcionar una alternativa ideal al calentamiento. Por ejemplo, las cadenas de ADN desnaturalizadas con agentes alcalinos como el NaOH se renaturalizan tan pronto como se agrega el tampón de fosfato .
Desnaturalización por aire
Las moléculas pequeñas y electronegativas , como el nitrógeno y el oxígeno , que son los gases principales en el aire , tienen un impacto significativo en la capacidad de las moléculas circundantes para participar en los enlaces de hidrógeno . Estas moléculas compiten con los aceptores de enlaces de hidrógeno circundantes por los donantes de enlaces de hidrógeno, por lo que actúan como "rompedores de enlaces de hidrógeno" y debilitan las interacciones entre las moléculas circundantes en el medio ambiente. Las hebras antiparelias en las dobles hélices de ADN están unidas de forma no covalente por enlaces de hidrógeno entre los pares de bases de Watson y Crick; Por lo tanto, el nitrógeno y el oxígeno mantienen el potencial de debilitar la integridad del ADN cuando se exponen al aire. Como resultado, las hebras de ADN expuestas al aire requieren menos fuerza para separarse y ejemplificar temperaturas de fusión más bajas .
Aplicaciones
Muchas técnicas de laboratorio se basan en la capacidad de las hebras de ácido nucleico para separarse. Al comprender las propiedades de la desnaturalización de ácidos nucleicos, se crearon los siguientes métodos:
Desnaturalizantes
Desnaturalizantes de proteínas
Ácidos
Los desnaturalizantes de proteínas ácidas incluyen:
Bases
Las bases funcionan de manera similar a los ácidos en la desnaturalización. Incluyen:
Disolventes
La mayoría de los solventes orgánicos son desnaturalizantes, incluyendo:
Reactivos de reticulación
Los agentes reticulantes de proteínas incluyen:
Agentes caotrópicos
Los agentes caotrópicos incluyen:
- Urea 6 - 8 mol / l
- Cloruro de guanidinio 6 mol / l
- Perclorato de litio 4,5 mol / l
- Dodecil sulfato de sodio
Reductores de enlaces disulfuro
Los agentes que rompen los enlaces disulfuro por reducción incluyen:
- 2-mercaptoetanol
- Ditiotreitol
- TCEP (tris (2-carboxietil) fosfina)
Agentes químicamente reactivos
Agentes como el peróxido de hidrógeno, cloro elemental, ácido hipocloroso (agua con cloro), bromo, agua con bromo, yodo, ácidos nítrico y oxidante, y el ozono reaccionan con restos sensibles como sulfuro / tiol, anillos aromáticos activados (fenilalanina) en efecto dañan el proteína y hacerla inútil.
Otro
- Agitación mecánica
- Ácido pícrico
- Radiación
- Temperatura
Desnaturalizantes de ácidos nucleicos
Químico
Los desnaturalizantes ácidos nucleicos incluyen:
- Ácido acético
- HCl
- Ácido nítrico
Los desnaturalizantes básicos de ácidos nucleicos incluyen:
- NaOH
Otros desnaturalizantes de ácidos nucleicos incluyen:
Físico
- Desnaturalización térmica
- Molino de cuentas
- Sonicación de sonda
- Radiación
Ver también
- Alcohol desnaturalizado
- Desarrollo del equilibrio
- Fijación (histología)
- Plegado de proteínas
- Bobina aleatoria