Celulasa - Cellulase
| Celulasa | |||||||||
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 Enzima celulasa producida por Thermomonospora fusca , con celotriosa unida en el surco poco profundo del dominio catalítico.
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| Identificadores | |||||||||
| CE no. | 3.2.1.4 | ||||||||
| No CAS. | 9012-54-8 | ||||||||
| Bases de datos | |||||||||
| IntEnz | Vista IntEnz | ||||||||
| BRENDA | Entrada BRENDA | ||||||||
| FÁCIL | NiceZyme vista | ||||||||
| KEGG | Entrada KEGG | ||||||||
| MetaCyc | camino metabólico | ||||||||
| PRIAM | perfil | ||||||||
| Estructuras PDB | RCSB PDB PDBe PDBsum | ||||||||
| Ontología de genes | AmiGO / QuickGO | ||||||||
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La celulasa es cualquiera de varias enzimas producidas principalmente por hongos , bacterias y protozoos que catalizan la celulólisis , la descomposición de la celulosa y de algunos polisacáridos relacionados . El nombre también se usa para cualquier mezcla o complejo natural de varias de dichas enzimas, que actúan en serie o sinérgicamente para descomponer el material celulósico.
Las celulasas descomponen la molécula de celulosa en monosacáridos ("azúcares simples") como la beta- glucosa , o polisacáridos y oligosacáridos más cortos . La descomposición de la celulosa tiene una importancia económica considerable, porque hace que un componente importante de las plantas esté disponible para el consumo y uso en reacciones químicas. La reacción específica involucrada es la hidrólisis de los enlaces 1,4-beta-D- glucosídicos en celulosa, hemicelulosa , liquenina y beta-D-glucanos de cereales . Debido a que las moléculas de celulosa se unen fuertemente entre sí, la celulólisis es relativamente difícil en comparación con la descomposición de otros polisacáridos como el almidón.
La mayoría de los mamíferos tienen una capacidad muy limitada para digerir las fibras dietéticas como la celulosa por sí mismos. En muchos animales herbívoros como los rumiantes como el ganado vacuno y ovino y en los fermentadores del intestino grueso como los caballos, las celulasas son producidas por bacterias simbióticas . Las celulasas endógenas son producidas por algunos tipos de animales metazoos, como algunas termitas , caracoles y lombrices de tierra .
Recientemente, también se han encontrado celulasas en microalgas verdes ( Chlamydomonas reinhardtii , Gonium pectorale y Volvox carteri ) y sus dominios catalíticos (CD) pertenecientes a la familia GH9 muestran la mayor homología de secuencia con las celulasas endógenas de metazoos. Las celulasas de algas son modulares y consisten en nuevos módulos de unión a carbohidratos ricos en cisteína putativos (CBM), enlazadores ricos en prolina / serina (PS) además de dominios supuestos similares a Ig y dominios desconocidos en algunos miembros. La celulasa de Gonium pectorale constaba de dos CD separados por enlazadores y con un CBM C-terminal.
Se conocen varios tipos diferentes de celulasas, que difieren estructural y mecánicamente. Los sinónimos, derivados y enzimas específicas asociadas con el nombre "celulasa" incluyen endo-1,4-beta-D-glucanasa (beta-1,4-glucanasa, beta-1,4-endoglucano hidrolasa, endoglucanasa D, 1,4 - (1,3,1,4) -beta-D-glucano 4-glucanohidrolasa), carboximetilcelulasa (CMCasa), avicelasa, celludextrinasa , celulasa A , celulosina AP , celulasa alcalina , celulasa A 3 , celulasa 9.5 y pancelasa SS . Las enzimas que escinden la lignina se han llamado ocasionalmente celulasas, pero este antiguo uso está desaprobado; son enzimas modificadoras de lignina .
Tipos y acción
Cinco tipos generales de celulasas según el tipo de reacción catalizada:
- Las endocelulasas (EC 3.2.1.4) rompen al azar los enlaces internos en los sitios amorfos que crean nuevos extremos de cadena.
- Las exocelulasas o celobiohidrolasas (EC 3.2.1.91) escinden de dos a cuatro unidades de los extremos de las cadenas expuestas producidas por la endocelulasa, dando como resultado tetrasacáridos o disacáridos , como la celobiosa . Las exocelulasas se clasifican además en tipo I, que funcionan de forma procesiva desde el extremo reductor de la cadena de celulosa, y tipo II, que funcionan de forma procesiva desde el extremo no reductor.
- Las celobiasas (EC 3.2.1.21) o las beta-glucosidasas hidrolizan el producto exocelulasa en monosacáridos individuales.
- Las celulasas oxidativas despolimerizan la celulosa mediante reacciones de radicales, como por ejemplo la celobiosa deshidrogenasa (aceptor) .
- Las fosforilasas de celulosa despolimerizan la celulosa utilizando fosfatos en lugar de agua.
La avicelasa tiene casi exclusivamente actividad exocelulasa, ya que el avicel es un sustrato muy microcristalino.
Dentro de los tipos anteriores también hay tipos progresivos (también conocidos como procesivos) y no progresivos. La celulasa progresiva continuará interactuando con una sola hebra de polisacárido, la celulasa no progresiva interactuará una vez y luego se desconectará y se conectará con otra hebra de polisacárido.
La acción de la celulasa se considera sinérgica ya que las tres clases de celulasa pueden producir mucho más azúcar que la adición de las tres por separado. Aparte de los rumiantes, la mayoría de los animales (incluidos los humanos) no producen celulasa en sus cuerpos y solo pueden degradar parcialmente la celulosa a través de la fermentación, lo que limita su capacidad para utilizar energía en material vegetal fibroso.
Estructura
La mayoría de las celulasas fúngicas tienen una estructura de dos dominios, con un dominio catalítico y un dominio de unión a celulosa, que están conectados por un enlazador flexible. Esta estructura está adaptada para trabajar sobre un sustrato insoluble y permite que la enzima se difunda bidimensionalmente sobre una superficie en forma de oruga. Sin embargo, también hay celulasas (principalmente endoglucanasas) que carecen de dominios de unión a celulosa.
Tanto la unión de sustratos como la catálisis dependen de la estructura tridimensional de la enzima que surge como consecuencia del nivel de plegamiento de proteínas . La secuencia de aminoácidos y la disposición de sus residuos que ocurren dentro del sitio activo, la posición donde se une el sustrato, pueden influir en factores como la afinidad de unión de los ligandos, la estabilización de los sustratos dentro del sitio activo y la catálisis. La estructura del sustrato es complementaria a la estructura precisa del sitio activo de la enzima. Los cambios en la posición de los residuos pueden provocar la distorsión de una o más de estas interacciones. Factores adicionales como la temperatura, el pH y los iones metálicos influyen en las interacciones no covalentes entre la estructura de la enzima. La especie Thermotoga maritima produce celulasas que constan de 2 láminas beta (estructuras proteicas) que rodean una región catalítica central que es el sitio activo. La enzima se clasifica como una endoglucanasa, que escinde internamente enlaces β-1,4-glicosídicos en las cadenas de celulosa, lo que facilita una mayor degradación del polímero. Diferentes especies de la misma familia que T. Maritima producen celulasas con diferentes estructuras. Las celulasas producidas por la especie Coprinopsis cinerea consta de siete cadenas de proteínas en forma de túnel cerrado llamado barril beta / alfa. Estas enzimas hidrolizan el sustrato carboximetilcelulosa. La unión del sustrato en el sitio activo induce un cambio de conformación que permite la degradación de la molécula.
Complejos de celulasa
En muchas bacterias, las celulasas in vivo son estructuras enzimáticas complejas organizadas en complejos supramoleculares , los celulosomas . Pueden contener, pero no se limitan a, cinco subunidades enzimáticas diferentes que representan endocelulasas, exocelulasas, celobiasis, celulasas oxidativas y fosforilasas de celulosa en las que solo las exocelulasas y celobiasas participan en la hidrólisis real del enlace β (1 → 4). El número de subunidades que componen los celulosomas también puede determinar la tasa de actividad enzimática.
Las celulasas multidominio están muy extendidas entre muchos grupos taxonómicos, sin embargo, las celulasas de bacterias anaeróbicas, que se encuentran en los celulosomas, tienen la arquitectura más compleja que consta de diferentes tipos de módulos. Por ejemplo, Clostridium cellulolyticum produce 13 celulasas modulares GH9 que contienen un número y una disposición diferentes de dominio catalítico (CD), módulo de unión a carbohidratos (CBM), dockerina, enlazador y dominio similar a Ig.
El complejo de celulasa de Trichoderma reesei , por ejemplo, comprende un componente marcado C1 (57,000 daltons ) que separa las cadenas de celulosa cristalina, una endoglucanasa (aproximadamente 52,000 daltons), una exoglucanasa (aproximadamente 61,000 daltons) y una beta-glucosidasa (76,000 daltons). daltons).
Se han identificado numerosas secuencias de "firma" conocidas como dockerinas y cohesinas en los genomas de bacterias que producen celulosomas. Dependiendo de su secuencia de aminoácidos y estructuras terciarias , las celulasas se dividen en clanes y familias.
Las celulasas multimodulares son más eficientes que la enzima libre (con solo CD) debido al sinergismo debido a la proximidad entre la enzima y el sustrato celulósico. Los CBM participan en la unión de la celulosa, mientras que los conectores glicosilados proporcionan flexibilidad a la CD para una mayor actividad y protección de proteasa, así como una mayor unión a la superficie de la celulosa.
Mecanismo de celulolisis
Usos
La celulasa se utiliza para el procesamiento comercial de alimentos en el café . Realiza la hidrólisis de la celulosa durante el secado de los granos . Además, las celulasas se utilizan ampliamente en la industria textil y en los detergentes para ropa. También se han utilizado en la industria de la pulpa y el papel para diversos fines, e incluso se utilizan para aplicaciones farmacéuticas. La celulasa se utiliza en la fermentación de biomasa en biocombustibles , aunque este proceso es relativamente experimental en la actualidad. Médicamente, la celulasa se utiliza como tratamiento para los fitobezoares, una forma de bezoar de celulosa que se encuentra en el estómago humano , y ha mostrado eficacia en la degradación de biopelículas bacterianas polimicrobianas al hidrolizar los enlaces glucosídicos β (1-4) dentro de los exopolisacáridos de matriz estructural de la sustancia polimérica extracelular (EPS).
Medición
Como el sustrato nativo, la celulosa , es un polímero insoluble en agua, los ensayos tradicionales de azúcar reductor que utilizan este sustrato no pueden emplearse para medir la actividad celulasa. Los científicos analíticos han desarrollado varios métodos alternativos.
- Método DNSA Se determinó la actividad de celulasa incubando 0,5 ml de sobrenadante con 0,5 ml de carboximetilcelulosa (CMC) al 1% en tampón citrato 0,05 M (pH 4,8) a 50ºC durante 30 minutos. La reacción se terminó mediante la adición de 3 ml de reactivo de ácido dinitrosalicílico. La absorbancia se leyó a 540 nm.
Puede usarse un viscosímetro para medir la disminución de la viscosidad de una solución que contiene un derivado de celulosa soluble en agua tal como carboximetilcelulosa tras la incubación con una muestra de celulasa. La disminución de la viscosidad es directamente proporcional a la actividad de la celulasa. Mientras que tales ensayos son muy sensibles y específicos para endo -cellulase ( exo -actuando enzimas de celulasa producen poco o ningún cambio en la viscosidad), que están limitados por el hecho de que es difícil de definir la actividad en unidades de enzima convencionales (micromoles de sustrato hidrolizado o producto producido por minuto).
Sustratos de celooligosacárido
Los celooligosacáridos de menor DP (DP2-6) son suficientemente solubles en agua para actuar como sustratos viables para las enzimas celulasa. Sin embargo, como estos sustratos son en sí mismos ' azúcares reductores ', no son adecuados para su uso en ensayos tradicionales de azúcares reductores porque generan un alto valor de 'blanco'. Sin embargo, su hidrólisis mediada por celulasa se puede controlar mediante métodos de HPLC o IC para obtener información valiosa sobre los requisitos de sustrato de una enzima celulasa particular.
Sustratos de celooligosacáridos reducidos
Los celooligosacáridos se pueden reducir químicamente mediante la acción del borohidruro de sodio para producir sus correspondientes alcoholes de azúcar . Estos compuestos no reaccionan en los análisis de azúcares reductores, pero sí lo hacen sus productos de hidrólisis. Esto hace que los celooligosacáridos reducidos con borohidruro sean sustratos valiosos para el ensayo de celulasa utilizando ensayos tradicionales de azúcar reductor como el método Nelson-Symogyi.
Sustratos de polisacáridos teñidos
Estos sustratos se pueden subdividir en dos clases:
- Sustratos cromogénicos insolubles: un sustrato de celulasa insoluble como AZCL-HE-celulosa absorbe agua para crear partículas gelatinosas cuando se coloca en solución. Este sustrato se despolimeriza y solubiliza gradualmente por la acción de la celulasa. La reacción se termina añadiendo una solución alcalina para detener la actividad enzimática y la suspensión de reacción se filtra o centrifuga. Se mide el color en el filtrado o el sobrenadante y se puede relacionar con la actividad enzimática.
- Sustratos cromogénicos solubles: Se incuba una muestra de celulasa con un sustrato soluble en agua como azo-CM-celulosa, se termina la reacción y se precipitan fragmentos parcialmente hidrolizados de alto peso molecular de la solución con un disolvente orgánico como etanol o metoxietanol. La suspensión se mezcla a fondo, se centrifuga y se mide el color en la solución sobrenadante (debido a fragmentos pequeños, solubles y teñidos). Con la ayuda de una curva estándar se puede determinar la actividad enzimática.
Reactivos acoplados a enzimas
Recientemente, nuevos reactivos han sido desarrollados que permiten la medición específica de endo -cellulase. Estos métodos implican el uso de sustratos de oligosacáridos funcionalizados en presencia de una enzima auxiliar. En el ejemplo que se muestra, una enzima celulasa es capaz de reconocer el fragmento de trisacárido de la celulosa y escindir esta unidad. La enzima auxiliar presente en la mezcla de reactivos (β-glucosidasa) actúa luego para hidrolizar el fragmento que contiene el cromóforo o fluoróforo. El ensayo finaliza con la adición de una solución básica que detiene la reacción enzimática y desprotona el compuesto fenólico liberado para producir la especie fenolato. La actividad celulasa de una muestra dada es directamente proporcional a la cantidad de fenolato liberado que puede medirse con un espectrofotómetro. La funcionalización acetal en el extremo no reductor del sustrato trisacárido evita la acción de la β-glucosidasa auxiliar sobre el sustrato original.
Ver también
- Celulosa 1,4-beta-celobiosidasa , una celulasa eficaz
- Unidad de celulasa , una unidad para cuantificar la actividad de la celulasa
Referencias
Otras lecturas
- Chapin FS, Matson PA, Mooney HA (2002). Principios de la ecología de los ecosistemas terrestres (PDF) . Nueva York: Springer. ISBN 978-0-387-95439-4. Archivado desde el original (PDF) el 5 de marzo de 2016 . Consultado el 4 de julio de 2014 .
- El Manual Merck de Diagnóstico y Terapia, Capítulo 24
- Deka D, Bhargavi P, Sharma A, Goyal D, Jawed M, Goyal A (2011). "Mejora de la actividad de celulasa de una nueva cepa de Bacillus subtilis por medio de optimización y análisis con varios sustratos celulósicos" . Investigación de enzimas . 2011 : 151656. doi : 10.4061 / 2011/151656 . PMC 3102325 . PMID 21637325 .
- Zafar M, Ahmed S, Khan MI, Jamil A (mayo de 2014). "Expresión recombinante y caracterización de una endoglucanasa novedosa de Bacillus subtilis en Escherichia coli". Informes de biología molecular . 41 (5): 3295-302. doi : 10.1007 / s11033-014-3192-8 . PMID 24493451 . S2CID 203374 .