Escaneo de alanina - Alanine scanning
En biología molecular , la exploración con alanina es una técnica de mutagénesis dirigida al sitio que se utiliza para determinar la contribución de un residuo específico a la estabilidad o función de una proteína determinada. La alanina se usa debido a su grupo funcional metilo no voluminoso y químicamente inerte que, sin embargo, imita las preferencias de estructura secundaria que poseen muchos de los otros aminoácidos. A veces, se utilizan aminoácidos voluminosos como la valina o la leucina en los casos en que se necesita la conservación del tamaño de los residuos mutados.
Esta técnica también se puede utilizar para determinar si la cadena lateral de un residuo específico juega un papel importante en la bioactividad . Esto generalmente se logra mediante mutagénesis dirigida al sitio o al azar mediante la creación de una biblioteca de PCR . Además, se han desarrollado métodos computacionales para estimar parámetros termodinámicos basados en sustituciones teóricas de alanina.
Esta técnica es rápida, porque muchas cadenas laterales se analizan simultáneamente y se evita la necesidad de purificación de proteínas y análisis biofísico. La tecnología está muy madura en este momento y se usa ampliamente en los campos bioquímicos. Los datos se pueden probar mediante IR , espectroscopia de RMN , métodos matemáticos, bioensayos, etc.
Un buen ejemplo de exploración con alanina es el examen del papel de los residuos cargados en la superficie de las proteínas. En un estudio sistemático sobre las funciones de los residuos cargados conservados en la superficie del canal de sodio epitelial ( ENaC ), se utilizó el escaneo de alanina para revelar la importancia de los residuos cargados para el proceso de transporte de las proteínas a la superficie celular.
Aplicaciones
Se utilizó Alanine Scanning para determinar simultáneamente las contribuciones funcionales de 19 cadenas laterales enterradas en la interfaz entre la hormona del crecimiento humana y el dominio extracelular de su receptor. Cada aminoácido de las cadenas laterales fue sustituido por alanina. Luego se utilizó el método de escaneo de escopeta que combina los conceptos de mutagénesis de escaneo de alanina y mutagénesis binomial con tecnología de presentación de fagos.
Otra aplicación crítica de la exploración con alanina es determinar la influencia de los residuos individuales sobre la estructura y la actividad en el ciclótido prototípico kalata B1. Los ciclótidos muestran una amplia gama de bioactividades farmacéuticamente importantes, pero su función natural es la defensa de las plantas como agentes insecticidas. En la estructura de los ciclótidos kalata B1, los 23 residuos distintos de cisteína se sustituyeron sucesivamente por alanina. Los datos se probaron mediante espectroscopia de RMN .
Además, la exploración con alanina también se usa para determinar qué motivo funcional de Cry4Aa tiene la actividad mosquitocida. Cry4Aa fue producido por Bacillus thuringiensis . Es una toxina específica de los dípteros y juega un papel importante en cómo producir un bioinsecticida para controlar los mosquitos. Por lo tanto, es muy esencial determinar qué motivo funcional de Cry4Aa contribuye a esta actividad. En este estudio, se hicieron varios mutantes Cry4Aa reemplazando los residuos del sitio de unión al receptor potencial, los bucles 1, 2 y 3 en el dominio II con alanina. Se siguió un bioensayo de Culex pipiens para probar las actividades.
Modelo Alanina-Mundo
El método de escaneo de alanina aprovecha el hecho de que la mayoría de los aminoácidos canónicos se pueden intercambiar con Ala mediante mutaciones puntuales, mientras que la estructura secundaria de la proteína mutada permanece intacta, ya que Ala imita las preferencias de estructura secundaria de la mayoría de los aminoácidos codificados o canónicos. . Esto es predicho por el modelo Alanine-World .
Referencias
Otras lecturas
- Michels CA (2002). Técnicas genéticas para la investigación biológica: un enfoque de estudio de caso . Londres: J. Wiley. pag. 111. ISBN 978-0-471-89921-1.